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3’-5’方向的dsDNA外切酶，從dsDNA鏈的3’端逐個(gè)去除單核苷酸

2024-11-22　　閱讀(129)

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重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是一種新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可以在37~42 ℃條件下，10~30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)待測靶標(biāo)的快速檢測。它具有反應(yīng)靈敏度高、特異性強(qiáng)、對儀器依賴程度低且可整合多種檢測模式等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層和現(xiàn)場即時(shí)檢測，可廣泛應(yīng)用于體外診斷、動物疫病、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。
圖1.RPA等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理圖[1]

 

目前常用的與RPA擴(kuò)增相結(jié)合的檢測方法有電泳法、熒光探針法、側(cè)流層析試紙條（LF-RPA）、絮凝分析檢測法，其中熒光探針法因操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、無需開蓋處理產(chǎn)物（減少氣溶膠污染）等優(yōu)勢，已發(fā)展為目前常用的一種結(jié)合RPA擴(kuò)增的檢測手段。熒光探針法RPA主要在RPA擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，加入了Exonuclease III和exo熒光探針，在RPA擴(kuò)增過程中Exonuclease III會特異地切割熒光探針（THF位點(diǎn)），導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開，熒光信號被檢測到，通過熒光收集的儀器來實(shí)時(shí)監(jiān)控?zé)晒庵档淖兓?。翌圣特推出一款Exonuclease III（Cat#14525ES），為RPA擴(kuò)增技術(shù)的廣泛應(yīng)用助力。
圖2.EXO探針法檢測原理圖[2]

 

翌圣Exonuclease III

翌圣Exonuclease III是一種無堿基序列依賴性的核酸外切酶，該酶作用于雙鏈DNA，從3’OH末端方向逐步切去單核苷酸。該酶能降解平滑末端、3’凹陷末端及有切口的DNA，但是不能降解3’-突出末端大于或等于四堿基的序列。此外，該酶也有RNase H、3’-磷酸酶、脫嘌呤/嘧啶（AP）位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶活性。

 

產(chǎn)品應(yīng)用

  • RPA擴(kuò)增中熒光探針的降解，釋放熒光信號；

  • 分子信號放大技術(shù)中雙鏈DNA 3’平末端切割；

  • 單鏈特異性探針的制備；

  • 制備用于雙脫氧測序的單鏈底物；

  • 雙鏈DNA的非定向巢式缺失。

     

性能展示

  • 無核酸內(nèi)切酶殘留

 



圖3.對翌圣Exonuclease III（Cat#14525ES）進(jìn)行核酸內(nèi)切酶殘留檢測，結(jié)果顯示測試組與對照組條帶無明顯差異，說明翌圣Exonuclease III（Cat#14525ES）無核酸內(nèi)切酶殘留。

 

  • 應(yīng)用于RT-RPA反應(yīng)，對RNA病毒的檢測限低至10 copies/T

圖4.用翌圣Exonuclease III（Cat#14525ES）進(jìn)行RT-RPA反應(yīng)，擴(kuò)增RNA病毒，檢測限低至10 copies/T。

 

  • 應(yīng)用于單克隆實(shí)驗(yàn)，提高單克隆陽性率

圖5.使用翌圣Exonuclease III（Cat#14525ES）在單克隆實(shí)驗(yàn)前處理PCR回收產(chǎn)物，用于酶切去除產(chǎn)物中的短片段，提高單克隆陽性率。結(jié)果顯示翌圣Exonuclease III（Cat#14525ES）可顯著提高單克隆陽性率，且效果優(yōu)于進(jìn)口品牌A*的Exonuclease III產(chǎn)品。

 

 

翌圣RPA相關(guān)產(chǎn)品推薦

 

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號

產(chǎn)品作用

Exonuclease III(100 U/μL)

14525ES

具有3’→5’外切酶活性，切斷熒光探針中淬滅基團(tuán)，釋放熒光

Bsu DNA polymerase(Large fragment,5U/μL)

11078ES

結(jié)合引物與原始靶核酸序列互補(bǔ)合成新的DNA模板

T4UvsXRecombinase(2μg/μL)

11079ES

具有配對和鏈轉(zhuǎn)移活性的重組酶

T4UvsY protein(2μg/μL)

11080ES

重組酶輔助因子，刺激T4UvsX的單鏈DNA依賴性ATP酶活性并降低活性所需的T4UvsX臨界濃度

T4 gene 32 protein(gp 32)T4噬菌體基因32編碼蛋白

11081ES

參與DNA復(fù)制、修復(fù)、重組與解鏈后的單鏈DNA結(jié)合，防止自雜交

Creatine Kinase(2μg/μL)肌酸激酶

14502ES

刺激ATP和肌酸分解為磷酸肌酸

 

參考文獻(xiàn)：
[1] 施奕,徐昌平,余蓓蓓,盧亦愚,梅玲玲.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展[J].病毒學(xué)報(bào), 2020,36(03):522-532.
[2] JiaLi, JoanneMacdonald, Stetten F. Review: a comprehensive summary of a decade development of the recombinase polymerase amplification[J]. The Analyst, 144.



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