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在分子生物學(xué)的實驗室里，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是日常工作中的一部分。這項技術(shù)以其高效、快速和特異性強的特點，成為了基因克隆、診斷檢測和研究中的核心工具。然而，即便是經(jīng)驗豐富的實驗者，也可能在PCR實驗中遇到一些難以察覺的陷阱。小翌將帶你深入探索那些在PCR實驗中容易被忽視，卻又至關(guān)重要的小細節(jié)。
PCR原理圖（點擊查看大圖）
PCR原理解析
PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）的原理是DNA要經(jīng)歷變性、退火、延伸步驟才能與引物、DNA聚合酶、dNTP結(jié)合形成新的雙鏈DNA分子，但實際需要的目標片段，得在三個循環(huán)之后才能得到。因此擴增循環(huán)數(shù)不能低于3，推薦循環(huán)數(shù)為30-40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物的得率計算公式為：
PCR產(chǎn)物得率=2N copies（N代表循環(huán)數(shù)）
但實際上，隨著循環(huán)數(shù)的增加，體系中的Taq酶、dNTP、引物等逐漸被消耗并伴隨著副產(chǎn)物的生成，使得PCR不能呈指數(shù)擴增，從而使實際的擴增曲線呈現(xiàn)“S"型，通常分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期三個階段，如圖所示。
PCR擴增曲線
循環(huán)數(shù)作為一個關(guān)鍵步驟，直接影響PCR反應(yīng)的結(jié)果。
陷阱1
循環(huán)數(shù)不足
如果DNA模板量較少，而循環(huán)次數(shù)太少，會導(dǎo)致目標DNA片段擴增產(chǎn)量低。
陷阱2
循環(huán)數(shù)過多
過多的循環(huán)雖然能增加產(chǎn)物量，但會導(dǎo)致反應(yīng)時間過長，非特異性產(chǎn)物擴增和假陽性的風(fēng)險也隨之上升。一般而言，PCR產(chǎn)物在25～35次循環(huán)后即可達最大值，進入“平臺期"。隨著副產(chǎn)物的積累以及試劑的消耗，即使再增加循環(huán)數(shù)，PCR產(chǎn)物量也不會再有明顯增加，出現(xiàn)擴增無法持續(xù)的停滯現(xiàn)象。
翌圣新推出的新一代快速PCR試劑（Cat#10167ES）可以抑制【擴增無法持續(xù)的停滯現(xiàn)象】，僅需30-35個循環(huán)數(shù)，即可獲得高得率的PCR產(chǎn)物。
圖1. 10167擴增576 bp大腸桿菌菌液，基因來源：擬南芥，性能優(yōu)于競品。延伸時間為30 sec/kb。循環(huán)數(shù)34 cycles。
引物
陷阱1
引物設(shè)計
引物設(shè)計過程中，需考慮TM值，GC含量、引物長度、引物二聚體的形成，但是往往會忽視3’末端的堿基，小翌建議小伙伴們引物3’末端的堿基最好為G或者C，可以提高引物與模板之間的結(jié)合穩(wěn)定性，降低產(chǎn)物的錯配。
陷阱2
引物濃度過高/過低
正常引物合成的量為2 OD，引物最初為干粉狀，依據(jù)引物質(zhì)量添加水至100 μmoL/L濃度（儲存液），要使用時稀釋10倍至10 μmoL/L濃度（工作液）即可。
在干粉狀階段，務(wù)必在3000 rpm/min條件下，離心1 min。如果未離心，在引物寄送的過程中，隨著快遞的上下翻飛，干粉會掛壁在管內(nèi)各處，添加的去離子水無法與所有引物混合，導(dǎo)致引物濃度變低，在后續(xù)的實驗中可能會導(dǎo)致目的片段的少量擴增或無擴增。
那有的小伙伴希望PCR產(chǎn)物量高，多加一點引物可以嗎？也是不行的，引物濃度如果過高，易造成錯配和非特異性擴增，且引物自身結(jié)合的概率增大，更易生成引物二聚體。
如下表顯示，10167ES引物添加量的終濃度為0.4-0.5 μM。依據(jù)說明書進行實驗，PCR實驗就可以事半功倍哦~
組分 | 體積（μL） | 體積（μL） | 終濃度 |
2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix* | 25 | 12.5 | 1× |
模板** | x | x | - |
正向引物F（10 μM）*** | 2 | 1 | 0.4-0.5 μM |
反向引物R（10 μM） | 2 | 1 | 0.4-0.5 μM |
ddH2O | Up to 50 | Up to 25 | - |
陷阱3
引物污染
因為小伙伴的引物作為反復(fù)凍融使用的材料，在使用過程中易造成污染，導(dǎo)致非特異擴增，所以小翌建議在使用過程中，引物作為ddH20之后，優(yōu)先添加的材料，防止因槍頭未更換等因素污染引物。
加樣步驟推薦：ddH20＞引物＞模板＞Mix酶
Mix酶最后添加：防止因過早添加酶試劑導(dǎo)致引物提早合成引物二聚體，避免非特異擴增，且大部分PCR Mix酶攜帶指示劑，可以用于區(qū)分該試管是否加樣完成。
需注意，PCR為冰上操作的實驗，但冰塊融化之后，如冰水浸沒引物、模板管子，易造成交叉污染，導(dǎo)致陰性對照出現(xiàn)假陽性。建議丟棄被冰水浸沒過的試劑，更換新試劑做實驗。或使用金屬冰盒，可避免發(fā)生浸沒的情況。
模板
陷阱1
模板DNA濃度
模板DNA在儲存的過程中會有一定程度的降解，因此放置前測試的濃度不一定準確，為了保證實驗精度，在放置一段時間后，需重新測試DNA模板濃度。
陷阱2
模板處理
小翌提醒，在進行酵母菌P的時候，需盡量將酵母模板處理好，有助于提高PCR擴增效率：酵母菌菌液及菌株煮沸5 min后放入-80℃冰箱3 min，待解凍后上樣。
10167ES擴增酵母菌
PCR技術(shù)雖然基礎(chǔ)，但也需要精確的控制和細心的調(diào)整。通過關(guān)注這些小細節(jié)，可以提高PCR實驗的成功率，為你的實驗和研究打下堅實的基礎(chǔ)。小翌提醒大家，見微知著，每一個小細節(jié)都可能成為PCR成功的關(guān)鍵。在分子生物學(xué)的世界里，細節(jié)往往決定成敗。小翌希望能夠幫助各位科研工作者更好地理解和掌握PCR技術(shù)，從而在研究中取得更好的成果！
產(chǎn)品推薦
2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix快速PCR預(yù)混液升級版
快速、高效、抑制停滯現(xiàn)象、提高產(chǎn)量
性能展示
菌落快速、高效擴增
圖1. 大腸桿菌菌落極限延伸時間擴增測試，3 kb以內(nèi)片段10167ES擴增的延伸效率可達1 sec/kb，6 kb片段擴增的延伸效率可達3 sec/kb，6-10 kb片段擴增的延伸效率可達5 sec/kb。M：10,000 DNA Marker（10505ES）。
長片段+高GC菌液快速、高效擴增
圖2. 長片段+高GC菌液擴增，結(jié)果顯示10167ES擴增產(chǎn)量高，檢出率100%，性能優(yōu)于競品。M：10,000 DNA Marker（10505ES）。10167ES擴增速度10 sec/kb，競品擴增15 sec/kb。
產(chǎn)品定位 | 名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
快速PCR升級，可菌P且適用復(fù)雜模板擴增 | 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix | 10167ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
1-7片段一步法定向連接，最快5分鐘完成重組反應(yīng) | Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit | 10923ES20/50 | 20 T/50 T |
