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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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聽說沒有，聽說沒有，最近有一款克隆試劑聽上去挺火的呀！
你說的是翌圣一步法快速克隆（Cat#10923ES）？
對(duì)對(duì)對(duì)，就是它，克隆陽性率高，上至7個(gè)連接片段，下至6 μL連接體系，你可以想不到，但它都可以做到！
這么牛嘛，有具體的實(shí)驗(yàn)案例嗎？
那就讓我們一起來看看大家是怎么成功獲得陽性克隆的吧~
單片段典型實(shí)驗(yàn)案例分析
來自同濟(jì)大學(xué)A課題組
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)
實(shí)驗(yàn)思路設(shè)計(jì)完整。
載體線性化全，載體、片段均純化。
載體：片段的摩爾比1：2。
連接反應(yīng)時(shí)間50℃，10 min。（小翌家的10923ES單片段連接也可快至5 min，歡迎嘗試~）
實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)且驗(yàn)證充分，菌P、測序均驗(yàn)證。
實(shí)驗(yàn)亮點(diǎn)
在10 μL小體系下，通過10923ES克隆試劑盒成功構(gòu)建了單基因過表達(dá)載體，陽性率可達(dá)100%。
多片段典型實(shí)驗(yàn)案例分析
來自同濟(jì)大學(xué)B課題組
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)
實(shí)驗(yàn)思路設(shè)計(jì)完整。
載體線性化全，載體、片段均純化。
載體/片段摩爾比為該實(shí)驗(yàn)者經(jīng)驗(yàn)累計(jì)，由1：2調(diào)整為1：1和1：3。小翌依舊推薦載體：片段的摩爾比1：2。
連接反應(yīng)時(shí)間50℃，30 min。（此為4片段連接標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間，小翌嚴(yán)選推薦！）
實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)且驗(yàn)證充分，菌P、測序均驗(yàn)證。
實(shí)驗(yàn)亮點(diǎn)
4片段+載體連接成功，克隆數(shù)優(yōu)于競品，陽性率100%。片段中包含高GC序列、3×flag標(biāo)簽，片段投入量小于50ng，連接難度較大。
看了以上兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，你是否也心癢難耐，想要一展身手！
要想獲得成功的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路和適合的實(shí)驗(yàn)方法是重中之重。小翌強(qiáng)烈推薦Hieff Clone®系列克隆試劑盒（Cat#10923ES），為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！那么實(shí)驗(yàn)記錄表也是要的，既可以幫助大家記錄實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，也能通過記錄表復(fù)盤實(shí)驗(yàn)思路，事半功倍！小翌根據(jù)自己做實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)了實(shí)驗(yàn)記錄本格式，放于文章最后，小伙伴們可自行取用~
載體大小 | bp | 片段大小1、2、3... | bp |
載體酶切位點(diǎn) | （如果為反向PCR，可不填） | 片段含同源臂的引物序列 | |
可通過翌圣無縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件 進(jìn)行引物設(shè)計(jì) | |||
線性化載體純化方式 | 片段純化方式 | ||
載體濃度 | ng/μL | 片段濃度 | ng/μL |
載體投入體積 | μL | 片段投入體積 | μL |
推薦翌圣—支持中心—生物計(jì)算器—克隆連接投入量計(jì)算板塊，輸入片段數(shù)、濃度、大小，即可獲得投入量： | |||
反應(yīng)條件 | 溫度 ℃、時(shí)間 min | ||
感受態(tài)轉(zhuǎn)化步驟 | 如：小翌的快速感受態(tài)細(xì)胞 1、提前15 min將LB平板放到37℃培養(yǎng)基中預(yù)熱。 2、將F-DH5α感受態(tài)細(xì)胞（DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）從-80℃拿出迅速插入冰上，待菌體融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物），輕輕彈勻，冰浴靜置5 min。 3、用200 μL移液槍將上一步的混合物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基上，均勻涂布。 4、將平板置于37℃培養(yǎng)箱倒置過夜培養(yǎng)。若進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，平板在37℃至少倒置培養(yǎng)15 h。 | ||
挑單菌落 | 用無菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至新一代快速菌落PCR Mix中混勻（2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix，Cat#10167ES），加入引物直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。共計(jì)挑 個(gè)單菌落，陽性率 （陽性條帶數(shù)/單菌落個(gè)數(shù)）。 | ||
測序 | （推薦使用一條載體通用測序引物+目的片段另一端引物送去測序驗(yàn)證） | ||
明星產(chǎn)品推薦
克隆實(shí)驗(yàn)流程 | 產(chǎn)品定位 | 名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
載體、片段制備 | 高保真PCR | 2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) | 10164ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
同源重組 | 1-7片段一步法定向連接，最快5分鐘完成重組反應(yīng) | Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit | 10923ES20/50 | 20 T/50 T |
轉(zhuǎn)化 | 5 min快速完成感受態(tài)轉(zhuǎn)化 | F DH5α化學(xué)感受態(tài) | 11803ES80 | 10×100 μL |
菌落PCR | 快速PCR升級(jí)，可菌P且適用復(fù)雜模板擴(kuò)增 | 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix | 10167ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
目的片段保存、測序 | TOPO克隆-兼容TA/平末端 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES20 | 20 T |
