隨著生物技術(shù)和分子醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，mRNA（信使核糖核酸）修飾技術(shù)及遞送技術(shù)也取得了較大進(jìn)展，并且由于mRNA具有開發(fā)簡(jiǎn)單快速、高特異性、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，在新冠疫情期間被制備成mRNA疫苗，一度成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的行業(yè)熱點(diǎn)。

已知，mRNA是一類攜帶遺傳信息并能直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成的單鏈核糖核酸，滿足合成各種蛋白質(zhì)的所有遺傳信息的要求。與DNA藥物相比，mRNA藥物不會(huì)插入基因組之中，其可通過正常代謝途徑分解，安全性更高。此外，mRNA藥物無需進(jìn)入細(xì)胞核就能發(fā)揮功能，可以通過體外轉(zhuǎn)錄，也可在患者體內(nèi)合成所需的治療性蛋白質(zhì)，設(shè)計(jì)和起效更加靈活快速，為個(gè)性化治療提供了新方法。

mRNA作為疫苗，可用于癌癥免疫治療、傳染病疫苗或蛋白質(zhì)替代等生物醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。mRNA作為治療藥物，有望成為多種難治性疾病的有力治療手段，包括代謝性遺傳疾病、癌癥、傳染性疾病、心腦血管疾病和其他疾病。

據(jù)國(guó)際市場(chǎng)研究和咨詢公司Mordor Intelligence的報(bào)告數(shù)據(jù)，2023年mRNA疫苗和療法的全球市場(chǎng)規(guī)模已經(jīng)達(dá)到了468.3億美元，且預(yù)計(jì)未來將以16.8%的復(fù)合年增長(zhǎng)率迅速擴(kuò)大，到2028年其全球市場(chǎng)規(guī)模有望攀升至1018億美元。其中根據(jù)nova one advisor統(tǒng)計(jì)，2023年全球mRNA治療市場(chǎng)的規(guī)模高達(dá)121.9億美元，預(yù)測(cè)2033年將超過589億美元，并預(yù)計(jì)在2024年至2033年間，其復(fù)合年增長(zhǎng)率將達(dá)到17.06%。

目前，mRNA的合成方式主要有化學(xué)合成、重組生產(chǎn)、酶法合成等，其中體外轉(zhuǎn)錄（酶法）被認(rèn)為是大規(guī)模生產(chǎn)mRNA金標(biāo)準(zhǔn)。mRNA疫苗制備流程主要包括：疫苗靶序列被導(dǎo)入質(zhì)粒中、質(zhì)粒DNA模板制備、mRNA體外轉(zhuǎn)錄、mRNA純化、mRNA包封制劑。在mRNA原料藥和制劑藥物產(chǎn)品生產(chǎn)制備過程中，需要進(jìn)行測(cè)試和過程分析，從而能夠更好地進(jìn)行質(zhì)量控制和成本控制。然而在mRNA藥物從早期研發(fā)、到成功上市需要經(jīng)歷多個(gè)階段，每個(gè)階段都存在極其復(fù)雜的不確定性，需要對(duì)其中多個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，從而確保最終產(chǎn)品的安全性和有效性。

雖然mRNA疫苗生產(chǎn)工藝流程相對(duì)來說比較簡(jiǎn)單，但mRNA疫苗是一項(xiàng)新興技術(shù)，研發(fā)上市與應(yīng)用時(shí)間也較短。法規(guī)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的要求也在隨著其工藝的成熟和市場(chǎng)應(yīng)用情況而不斷發(fā)展更新，其生產(chǎn)過程中采用的方法大都是復(fù)雜的，因此質(zhì)量控制仍有很多的挑戰(zhàn)。

表1.國(guó)內(nèi)外藥典法規(guī)關(guān)于mRNA疫苗的指導(dǎo)原則和質(zhì)控放行要求

其中，美國(guó)藥典委員會(huì)(USP)于今年7月份又更新和發(fā)布了mRNA疫苗和治療產(chǎn)品質(zhì)量分析方法-指南草案(第三版）。主要更新了質(zhì)粒DNA相關(guān)的質(zhì)量屬性，要求在：任何一種情況下，用于制造mRNA疫苗的每一批質(zhì)粒DNA，都必須在釋放前進(jìn)行測(cè)試，以確認(rèn)其身份、純度和質(zhì)量。值得關(guān)注的更新細(xì)節(jié)為：對(duì)宿主殘留RNA檢測(cè)要求細(xì)化了，并對(duì)殘留限度也做出了要求。

此外，針對(duì)線性和自復(fù)制mRNA，2023年更新的第二版和今年更新的第三版草案也都提到在mRNA藥物原料表征和放行檢驗(yàn)中，純度檢測(cè)這塊新增工藝相關(guān)雜質(zhì)-殘留的T7 RNA聚合酶含量檢測(cè)，這是對(duì)mRNA工藝過程中引入的單酶雜質(zhì)檢測(cè)提出質(zhì)控要求。

針對(duì)mRNA疫苗進(jìn)行的質(zhì)量控制，不僅關(guān)系到疫苗的安全性（如確保疫苗中不含有內(nèi)毒素、微生物和其他潛在的有害物質(zhì)），還影響疫苗的有效性，即刺激免疫反應(yīng)的能力，這就需要質(zhì)量控制確保疫苗中mRNA的含量、純度和生物學(xué)活性達(dá)到預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，鑒于疫情的影響，建立能夠快速開發(fā)和高度復(fù)雜的mRNA疫苗質(zhì)量控制流程，還有助于應(yīng)對(duì)全球公共衛(wèi)生危機(jī)。因此，中美歐等國(guó)內(nèi)外的監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)于mRNA疫苗的質(zhì)量安全控制檢測(cè)都嚴(yán)格管控。

針對(duì)上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了一系列mRNA疫苗研發(fā)和生產(chǎn)等流程中所需的質(zhì)量安全控制檢測(cè)試劑盒，其中包括早期的質(zhì)粒DNA模板檢測(cè)所需的宿主細(xì)胞殘留DNA、殘留RNA、殘留蛋白等檢測(cè)試劑盒，以及mRNA原液生產(chǎn)工藝過程中所需的各種關(guān)鍵酶殘留檢測(cè)試劑盒等。

圖1.mRNA藥物研發(fā)及生產(chǎn)流程中翌圣質(zhì)控產(chǎn)品推薦

去除宿主細(xì)胞雜質(zhì)是mRNA疫苗、抗體藥物等在內(nèi)的生物制藥產(chǎn)品生產(chǎn)中的關(guān)鍵步驟，其中宿主細(xì)胞殘留DNA由于可能存在的免疫原性、感染性以及致瘤性等安全問題成為關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)。在此情況下，建立合適的檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)生產(chǎn)工藝，控制宿主細(xì)胞殘留核酸限度，以確保產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量已經(jīng)成為監(jiān)管機(jī)構(gòu)和行業(yè)內(nèi)關(guān)注的重點(diǎn)。

此外，《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版第三部規(guī)定，外源性DNA殘留檢測(cè)采用DNA探針雜交法、熒光染色法和定量PCR法。目前市場(chǎng)上對(duì)宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)，主要采用熒光探針qPCR方法，qPCR法具有高的靈敏度、序列特異性和準(zhǔn)確性，可為生物制藥工業(yè)在工藝研究和成品質(zhì)量控制方面提供可靠的檢測(cè)手段，現(xiàn)也已成為各生物制品廠家檢測(cè)方法。

翌圣生物自主研發(fā)的E.coli宿主細(xì)胞殘留DNA的qPCR法檢測(cè)試劑盒，可快速高效檢測(cè)生物藥中宿主DNA殘留量。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動(dòng)化核酸提取儀器。

圖2. E.coli DNA (2G)標(biāo)曲范圍30fg/μL~300pg/μL，R2=1，擴(kuò)增效率為101.74%，各濃度檢測(cè)值CV<15%

生物制品中HCP殘留含量通常被認(rèn)為是產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)，是工藝穩(wěn)健性監(jiān)測(cè)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，也是產(chǎn)品的重要質(zhì)控指標(biāo)。各國(guó)法規(guī)都有涉及HCP的論述，要求必須對(duì)生物藥品進(jìn)行分析和純化，以將宿主細(xì)胞蛋白HCP降低到可接受的水平。

《中國(guó)藥典》三部（2020版）規(guī)定：針對(duì)CHO細(xì)胞，HCP殘留需要<0.05%（相當(dāng)于小于500ppm）；針對(duì)E.coli，HCP殘留需要<0.01%。

美國(guó)藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測(cè)藥品中的HCP，其含量應(yīng)該低于檢測(cè)限（通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCP含量應(yīng)小于100ng，也即<0.01%）。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是目前HCP檢測(cè)常用的方法，在2020版《中國(guó)藥典》通則3412/3413/3414中提到的宿主蛋白殘留檢測(cè)方法均為ELISA法。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研發(fā)了包括E.coil宿主細(xì)胞在內(nèi)的多款HCP蛋白殘留量檢測(cè)試劑盒。試劑盒均采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)（ELISA）的實(shí)驗(yàn)原理，以及生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)，能夠高靈敏的檢測(cè)樣本中HCP殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優(yōu)化、中間工藝過程的雜質(zhì)控制以及終產(chǎn)品的放行檢測(cè)。

圖3. 翌圣HCP ELISA試劑盒產(chǎn)品特點(diǎn)

已知，mRNA疫苗規(guī)?；a(chǎn)過程中涉及的工具酶主要包括T7 RNA聚合酶、Inorganic Pyrophosphatase無機(jī)焦磷酸酶、Vaccinia Capping Enzyme牛痘病毒加帽酶、RNA Inhibitor RNA酶抑制劑等。

在使用這些工具酶進(jìn)行mRNA疫苗研發(fā)和生產(chǎn)的同時(shí)，會(huì)引入這些工藝相關(guān)雜質(zhì)即工具酶的殘留，故需使用酶殘留檢測(cè)ELISA試劑盒進(jìn)行mRNA合成相關(guān)酶含量監(jiān)測(cè)。在殘留量低于一定范圍時(shí)，純化的mRNA工藝過程制備液才可以進(jìn)入下一生產(chǎn)階段。

為此，翌圣生物又開發(fā)了針對(duì)mRNA合成所需酶殘留檢測(cè)的ELISA試劑盒，該試劑盒應(yīng)用雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)的實(shí)驗(yàn)原理進(jìn)行酶殘留量檢測(cè)，將mRNA合成所需酶標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本加入預(yù)包被抗工具酶抗體的酶標(biāo)板，然后加入稀釋后的生物素標(biāo)記的工具酶檢測(cè)抗體，最后加入Streptavidin-HRP (SA-HRP)，形成抗體+抗原+抗體-Biotin+SA-HRP復(fù)合物，洗板后加入TMB顯色液顯色。TMB在HRP酶的催化下由無色轉(zhuǎn)化成藍(lán)色并在終止液的作用下最終轉(zhuǎn)化成黃色。黃色的深淺與樣本中被檢測(cè)到的工具酶的量呈正相關(guān)。

圖4. 翌圣生物mRNA合成關(guān)鍵酶殘留檢測(cè)的ELISA實(shí)驗(yàn)過程