分子診斷是以 DNA、RNA 或蛋白質分子為診斷材料，通過檢查人體內源基因或外源(病原體）基因的存在、缺陷或表達異常，對人體狀態(tài)或疾病作出特異性診斷的方法和過程。分子診斷技術主要是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction簡稱PCR）、原位雜交FISH、基因芯片和基因測序技術，與雜交、高通量測序技術相比，PCR技術主要優(yōu)勢在于靈敏度更高、特異性更強、操作簡單且易于推廣，在檢測基因數(shù)量上有一定的局限性，但從短期來看，PCR技術仍將是分子診斷的主流技術。

翌圣生物在酶原料領域深耕多年，長期為IVD企業(yè)、第三方檢驗機構、科研機構等提供高品質、高性價比的分子診斷PCR原料，包括逆轉錄酶、RNase 抑制劑、Taq DNA 聚合酶、尿嘧啶糖基化酶（UDG/UNG酶）、taq酶抗體、dNTPs等單組份以及經(jīng)過體系優(yōu)化的qPCR/RT-qPCR預混液，可為臨床/非臨床診斷試劑盒開發(fā)提供性能優(yōu)、穩(wěn)定的酶原料。

分子診斷PCR擴增工作流程及原料一覽

一、核心酶原料-Taq DNA聚合酶

隨著應用檢測領域的拓展和市場需求的提升，野生型Taq DNA聚合酶已不能滿足需求，翌圣ZymeEditorTM酶改造平臺針對不同的應用需求，定向改造了Taq DNA 聚合酶，推出一系列適合全預混、耐抑制、超潔凈等匹配不同應用方向的熱啟動Taq DNA 聚合酶。

• 優(yōu)yue的穩(wěn)定性：配制成含引物探針的全預混液，37℃ 7天處理后，低濃度檢出無變化

圖1：以HBV核酸為模板，使用10726ES配制成qPCR全預混液，除模板外所有體系在37℃下放置7天測試加速穩(wěn)定性。結果顯示：高、中、低濃度Ct值和熒光值無顯著變化，表明以10726ES配制的預混液性能穩(wěn)定。

• 宿主gDNA殘留低：E. coli基因組DNA殘留＜0.5 copies/ 100 U

圖2：E. coli基因組線性范圍：30 fg/μL-300 pg/μL，相關性R2=0.9999。(B) 三批次Hieff UCF.ME® Sensitive Taq DNA Polymerase的E. coli基因組DNA殘留＜0.5 copies/ 100 U。

二、核心酶原料-逆轉錄酶

作為RT-qPCR反應的關鍵原料之一，逆轉錄酶需要具備更快的逆轉錄速度、更高的合成產(chǎn)量以及更好的耐熱性能。為了獲得更適用于RT-qPCR的逆轉錄酶，翌圣生物在M-MLV的基礎上通過基因改造，開發(fā)出RNaseH活性更低，熱穩(wěn)定性更高，持續(xù)合成能力更強的Hifair®系列逆轉錄酶。

• 可耐受58℃反應溫度，適合復雜RNA模板的逆轉錄

圖3：將Hifair® V Reverse Transcriptase及進口品牌T*的逆轉錄酶分別在55℃及58℃下孵育30min檢測殘余酶活。結果顯示Hifair® V Reverse Transcriptase在58℃下孵育30min仍能保持70%活性，遠超進口品牌。

• 應用于RT-qPCR檢出率優(yōu)于其他品牌，檢出范圍：1 pg-1 μg

圖4：以1 pg-1 μg（7個梯度）的293T細胞總RNA為模板，使用Hifair® V one-step RT-gDNA digestion SuperMix for qPCR(Cat#11142)、V*、T*進行逆轉錄，得到的cDNA進行qPCR定量分析。結果顯示，11142ES靈敏度可達1 pg，檢出率優(yōu)于競品。

三、其他酶及酶抑制劑：RNase抑制劑、UDG酶

翌圣提供多種歷經(jīng)IVD工業(yè)應用驗證的酶、RNase 酶抑制劑、Taq酶抗體等原料產(chǎn)品，為廣泛的體外診斷產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)提供豐富的高品質原料解決方案，相關酶類等產(chǎn)品在保護分子檢測目標產(chǎn)物中廣泛應用。

RNase 酶抑制劑：翌圣以可溶形式在大腸桿菌中表達純化的重組鼠源/豬源RNase抑制劑，能夠廣泛抑制各種類型RNase(RNase A, B, C)，并且該抑制劑不會抑制聚合酶的活性，已驗證可廣泛應用于RT-PCR/qPCR、RNA-seq、cDNA克隆和文庫構建等多個應用場景。除了常規(guī)RNase抑制劑，還開發(fā)了經(jīng)過UCF.ME®超低殘留工藝處理，宿主殘留更低，適合對背景菌要求更為嚴格的應用場景的RNase抑制劑，助力解決病原檢測中的背景菌干擾，提高檢測準確度。

UDG酶：尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），與dUTP搭配使用，可建立PCR防污染體系，翌圣研發(fā)的熱敏、低殘留UDG酶，可避免常規(guī)UDG酶滅活后可能存在的殘留活性在常溫下對含dU擴增產(chǎn)物的降解作用，同時防止分子酶中存在的背景菌造成PCR結果假陽性，對于準確鑒別感染病原體，協(xié)助感染、傳染病的臨床診斷至關重要。

Taq酶抗體：非特異性擴增是顯著影響PCR性能的主要問題之一，熱啟動技術可以有效減少非特異擴增?？贵w修飾的熱啟動酶封閉效率高，效果佳，室溫下穩(wěn)定，酶活釋放速度快，翌圣生物開發(fā)的熱啟動Taq酶雙封閉抗體不僅可以封閉Taq酶的5'→3'聚合酶活性，還能同時封閉Taq酶的5'→3'外切酶活性，雙管齊下，既能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增，又能防止探針或引物降解產(chǎn)生非特異信號，雙重提升試劑的穩(wěn)定性。

四、通用高性能全預混qPCR預混液

翌圣生物提供高品質qPCR試劑，高性能的熱啟動Taq酶搭配優(yōu)化的緩沖體系，可提供包括通用型預混液，全預混預混液，基因分型預混液，可凍干預混液等，具有使用簡便、靈敏度高、穩(wěn)定性強的特點，加快您的分子診斷產(chǎn)品開發(fā)。

• 試劑通用性好：適配多類型多重引探（已驗證超40種不同類型靶標），具有優(yōu)秀的擴增性能；

• 強全預混穩(wěn)定性：37℃可放置14天，4℃可放置28天，反復凍融50次性能穩(wěn)定；

• 靈敏度高特異性好：靈敏度可檢測到0.25 copy/μL，特異性48孔陰性不起峰；

• 支持快速程序：兼容快速程序，30min即可出結果；

• dUP/UDG防污染體系：引入了dUTP/UDG防污染系統(tǒng)，可有效防止氣溶膠污染；

• 多平臺多體系適用： Bio-Rad CFX96、ABI Q5、7500、Slan、天隆等均適配。

圖5：基于全預混試劑穩(wěn)定性考察，實驗組與對照組試劑的Ct值偏差(△Ct值)在±0.5以內，熒光值偏差在15%以內，翌圣全預混試劑具有優(yōu)秀的多重擴增穩(wěn)定性能。

對16710ES分別進行三種方式處理(4℃、37℃以及凍融)。實驗組于4℃、37℃分別處理7天，凍融50次，與對照組(-20℃保存)在4組多重擴增體系（組1、組2及組4為4重擴增體系，組3為3重擴增體系）下進行穩(wěn)定性測評。

五、通用高靈敏RT-qPCR預混液

一步法RT-qPCR試劑整合逆轉錄酶和熱啟動酶的優(yōu)性能，配合優(yōu)化的緩沖體系，可實現(xiàn)個位數(shù)拷貝模板的快速靈敏檢測，經(jīng)過呼吸道疾病、動物疫病、科研體系等各類客戶市場驗證，可滿足各種應用方向的需求。

• 通用性強：適用病原微生物、人源基因組、植物等多物種的核酸進行qPCR擴增、檢測；

• 優(yōu)異的擴增靈敏度：精心優(yōu)化的緩沖體系，提高了低濃度模板的檢測靈敏度，可高達250 copies/mL；

• dUTP/UDG 防污染系統(tǒng)：引入 dUTP/ Heat-labile UDG 防污染系統(tǒng)，高效降解產(chǎn)物的氣溶膠污染，降低假陽性，確保結果真實可信；

• 支持快速程序：兼容快速程序，40 min內完成結果檢測；

• 優(yōu)異的儲存穩(wěn)定性：37℃放置14天、反復凍融10次試劑性能穩(wěn)定。

圖6：使用翌圣RT-qPCR預混合（16630ES）和市面上同類產(chǎn)品Supplier-A，同時檢測4個病原靶標（副流感病毒HPIV2、副流感病毒HPIV4、呼吸道合胞病毒HRVA和鼻病毒RSVA），結果顯示16630ES檢測靈敏度高于supplier-A。

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