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在精準(zhǔn)醫(yī)療浪潮中，基因治療作為具潛力的前沿技術(shù)，從基因?qū)用嬷睋艏膊「?，有望?shí)現(xiàn)「一次治療，終生獲益」的長(zhǎng)期臨床效果。當(dāng)下，基因治療已在罕見(jiàn)病、眼科疾病、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤治療等難治性疾病領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展。

腺相關(guān)病毒（AAV）載體憑借高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、強(qiáng)組織與細(xì)胞靶向性，以及低免疫原性等顯著優(yōu)勢(shì)，在基因治療領(lǐng)域脫穎而出，成為應(yīng)用最為廣泛的基因遞送工具。

當(dāng)前，美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn) 8 款 AAV 基因療法上市。國(guó)內(nèi)基因治療領(lǐng)域進(jìn)展頗多。信念醫(yī)藥研發(fā)的針對(duì)血友病 B 的 AAV 基因療法正處于獲批上市的關(guān)鍵階段，有望填補(bǔ)國(guó)產(chǎn) AAV 基因療法上市的空白。

今年 2 月，復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院舒易來(lái)教授憑借雙 AAV 基因療法，使耳聾患者聽(tīng)力得到恢復(fù)，成為 34 年來(lái)榮獲“臨床科學(xué)創(chuàng)新獎(jiǎng)" 的亞洲科學(xué)家。

同月，特寶生物通過(guò)收購(gòu)九天生物部分資產(chǎn)，將多個(gè) AAV 基因療法研發(fā)管線納入旗下，交易總價(jià)最高可達(dá) 5800 萬(wàn)美元，這一舉措助力特寶生物迅速切入 AAV 基因療法領(lǐng)域，加速創(chuàng)新基因治療產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，也進(jìn)一步彰顯了國(guó)內(nèi) AAV 基因療法產(chǎn)業(yè)的廣闊前景。

近日，一名接受 Sarepta 杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）基因療法 Elevidys 的青少年男孩因肝功能衰竭死亡。在接受 Elevidys 臨床試驗(yàn)和商業(yè)治療的 800 多名患者中，這是第一例患者死亡病例。該事件在行業(yè)內(nèi)引發(fā)軒然大波，引發(fā)各界對(duì) AAV 基因療法安全性的深刻思考，也進(jìn)一步凸顯出 AAV 生產(chǎn)環(huán)節(jié)嚴(yán)格把控的重要性。

事實(shí)上，AAV 病毒載體生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)面臨諸多挑戰(zhàn)。生產(chǎn)環(huán)節(jié)復(fù)雜，病毒載體生產(chǎn)與純化過(guò)程中存在工藝放大難、純化難度大、穩(wěn)定性欠佳等問(wèn)題，大規(guī)模生產(chǎn)仍是該領(lǐng)域亟待攻克的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念強(qiáng)調(diào)了前置藥物的質(zhì)量控制，這也意味著企業(yè)從原材料的選擇上就要嚴(yán)格把關(guān)以符合監(jiān)管要求，規(guī)避后續(xù)可能存在的風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)從 AAV 病毒生產(chǎn)上游工藝中質(zhì)粒、產(chǎn)毒株細(xì)胞和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染三個(gè)方面剖析影響 AAV 生產(chǎn)規(guī)?；挠绊懸蛩?。

質(zhì)粒是生產(chǎn) AAV 的起始原料，通常在重組大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中獲取。質(zhì)粒生產(chǎn)流程涵蓋發(fā)酵、菌體收集、菌體裂解、固液分離、澄清、層析以及濃縮等多個(gè)環(huán)節(jié)。在質(zhì)粒大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中，多個(gè)因素協(xié)同影響質(zhì)粒產(chǎn)率。

在質(zhì)粒大規(guī)模純化環(huán)節(jié)，堿裂解法是裂解菌體的常用方法。在此過(guò)程中，需嚴(yán)格控制 pH 值、剪切力和裂解時(shí)間，防止過(guò)度裂解對(duì)質(zhì)粒造成損傷。層析純化作為大規(guī)模質(zhì)粒純化的主流技術(shù)，填料孔徑的選擇對(duì)質(zhì)粒吸附性能影響顯著。企業(yè)需根據(jù)質(zhì)粒特性，選擇合適的填料，以實(shí)現(xiàn)高效純化。

理想的產(chǎn)毒株細(xì)胞系應(yīng)具備生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)便捷、能高效支持 AAV 病毒復(fù)制和包裝的特點(diǎn)。此外，細(xì)胞系來(lái)源需可溯源，無(wú)外源因子污染，并且在規(guī)?；囵B(yǎng)過(guò)程中保持傳代穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性和狀態(tài)穩(wěn)定性。

目前，HEK293 細(xì)胞貼壁培養(yǎng)技術(shù)常用于實(shí)驗(yàn)室小劑量病毒生產(chǎn)。而懸浮無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，如 HEK293、SF9 等細(xì)胞系的應(yīng)用，極大地簡(jiǎn)化了 AAV 生產(chǎn)的工藝放大流程，同時(shí)減輕了下游純化的負(fù)擔(dān)。

為保障細(xì)胞系在規(guī)?；囵B(yǎng)中的穩(wěn)定性，需定期進(jìn)行細(xì)胞鑒定，采用 STR（短串聯(lián)重復(fù)序列）分型技術(shù)確保細(xì)胞身份的準(zhǔn)確性，通過(guò)支原體檢測(cè)試劑盒杜絕支原體污染。

轉(zhuǎn)染效率低、質(zhì)粒 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑成本高，是 AAV 載體生產(chǎn)面臨的主要難題。

聚乙烯亞胺（PEI）是 AAV 規(guī)?；a(chǎn)中應(yīng)用廣泛的轉(zhuǎn)染試劑，雖價(jià)格低廉，但對(duì)細(xì)胞具有一定毒性，且對(duì)環(huán)境 pH 變化較為敏感。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，細(xì)胞毒性低，然而試劑費(fèi)用高昂，在大規(guī)模生產(chǎn)中成本壓力較大。磷酸鈣轉(zhuǎn)染雖成本較低，但試劑純度和 pH 敏感性會(huì)導(dǎo)致 AAV 生產(chǎn)批次間差異顯著。

在三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，質(zhì)粒分配比例的失衡會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)而導(dǎo)致空衣殼比率出現(xiàn)明顯的批次差異。構(gòu)建衣殼基因序列及其它生產(chǎn)相關(guān)基因序列穩(wěn)定整合的 AAV 包裝細(xì)胞系統(tǒng)，有望解決這一問(wèn)題。

在生物制藥領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn) AAV 規(guī)?；a(chǎn)，搭建穩(wěn)定且易放大的生產(chǎn)體系是工藝開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)之一。在如今藥物開(kāi)發(fā)競(jìng)爭(zhēng)的大環(huán)境下，構(gòu)建這樣一套生產(chǎn)體系，需以耗費(fèi)大量的人力成本、時(shí)間和金錢成本為代價(jià)，無(wú)疑加重企業(yè)和研發(fā)人員的負(fù)擔(dān)。

為助力行業(yè)突破 AAV 規(guī)?；a(chǎn)的重重難關(guān)，2025 年 4 月 17 日（周四）19：00 - 20 ：30，醫(yī)麥客攜手翌圣生物和行誠(chéng)生物共同推出的主題為「從質(zhì)粒到轉(zhuǎn)染：AAV規(guī)?；a(chǎn)中的關(guān)鍵原料技術(shù)突破與合規(guī)性實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)分享」的直播課。

屆時(shí)，翌圣生物研發(fā)總監(jiān)滕以剛博士和行誠(chéng)生物李軍輝博士將結(jié)合切身豐富的 AAV 生產(chǎn)項(xiàng)目經(jīng)歷，深度剖析 AAV 規(guī)?；a(chǎn)的質(zhì)粒制備、轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié)的技術(shù)要點(diǎn)，助力大家突破技術(shù)瓶頸。歡迎大家積極報(bào)名！

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