HB170102

【技術(shù)帖】NGS文庫(kù)質(zhì)檢方法與注意事項(xiàng)

——文庫(kù)大小、質(zhì)量、污染物評(píng)測(cè)

    文庫(kù)的質(zhì)量對(duì)于高通量測(cè)序（NGS）產(chǎn)出的數(shù)據(jù)質(zhì)量至關(guān)重要。過低估計(jì)文庫(kù)的質(zhì)量，導(dǎo)致Clusters或多重模板太多，數(shù)據(jù)質(zhì)量不高；過高估計(jì)文庫(kù)的質(zhì)量，導(dǎo)致數(shù)據(jù)讀取量少，基因組覆蓋率低，所以低估或者高估文庫(kù)質(zhì)量都會(huì)影響測(cè)序效果。

那么，如何判斷你做出來的文庫(kù)是可以用于上機(jī)測(cè)序的，而不是白費(fèi)力氣建了個(gè)沒用的文庫(kù)？或者更糟糕，構(gòu)建出的文庫(kù)可以上機(jī)測(cè)序，但是得到了一堆沒有用的數(shù)據(jù)？

不要擔(dān)心，如果你的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)精良，你只需要做3步簡(jiǎn)單的質(zhì)控就可以判斷文庫(kù)是否合格。

  Bioanalyzer——文庫(kù)長(zhǎng)度檢測(cè)

  qPCR/Qubit——文庫(kù)定量

  Nanodrop——文庫(kù)污染物檢測(cè)

1. 文庫(kù)長(zhǎng)度檢測(cè)

文庫(kù)長(zhǎng)度檢測(cè)是文庫(kù)質(zhì)控的關(guān)鍵步驟。測(cè)序上機(jī)時(shí)，要求文庫(kù)等摩爾上樣（否則可能造成不同文庫(kù)簇生成密度不同，而影響測(cè)序質(zhì)量），文庫(kù)的平均長(zhǎng)度是計(jì)算文庫(kù)摩爾數(shù)的要素之一。

文庫(kù)摩爾數(shù)（pmol）≈ 文庫(kù)質(zhì)量(ng)/ [0.66×文庫(kù)平均長(zhǎng)度（bp）]

Agilent Bioanalyzer是進(jìn)行文庫(kù)長(zhǎng)度檢測(cè)zui常用的儀器，它基于微控流技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行分離檢測(cè)。根據(jù)加樣要求，在DNA芯片中加入Ladder、Marker、Gel、Dye以及Sample，當(dāng)給芯片加入電壓時(shí)，樣品便在芯片上的顯微蝕刻管道中進(jìn)行毛細(xì)管電泳，在樣本流動(dòng)過程中，不同DNA根據(jù)其大小被分離。同時(shí)凝膠-染料基質(zhì)中的熒光染料可嵌入DNA雙鏈，通過激光激發(fā)熒光，使其被儀器檢測(cè)到，儀器依據(jù)收集到的熒光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)樣本粗略定量。

一般情況下，好的文庫(kù)應(yīng)該呈現(xiàn)出單一的、圓滑的峰，且接近正態(tài)分布，長(zhǎng)度范圍在150-700bp之間。如下圖為使用100 ng E.coli gDNA建庫(kù)，接頭連接后進(jìn)行雙輪分選（0.6×/0.2×和0.55×/0.15×）的檢測(cè)結(jié)果。

   有時(shí)，文庫(kù)也可能在150-700bp的范圍之外出現(xiàn)雜峰。不同的雜峰大小與峰形可參照以下情況進(jìn)行分析和實(shí)驗(yàn)改進(jìn)。

1) 在150bp以下出現(xiàn)雜峰

這種情況可認(rèn)為是文庫(kù)擴(kuò)增時(shí)的引物二聚體殘留或接頭殘留導(dǎo)致的，可以通過稍微降低磁珠使用比例重新純化文庫(kù)解決。注意，磁珠使用過程中的移液操作，切勿擾動(dòng)磁珠。

2）在700bp以上出現(xiàn)雜峰

    這種情況可認(rèn)為是文庫(kù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)過高，出現(xiàn)文庫(kù)過度擴(kuò)增自我交聯(lián)導(dǎo)致的，可以通過文庫(kù)重新分選解決。

3）整個(gè)文庫(kù)呈現(xiàn)大小不對(duì)稱

   這種情況可認(rèn)為文庫(kù)分選操作不良或Input DNA的片段化不*導(dǎo)致的，可以通過重新進(jìn)行文庫(kù)分選或者重新構(gòu)建文庫(kù)解決。

2. 文庫(kù)濃度檢測(cè)

文庫(kù)質(zhì)量也是計(jì)算文庫(kù)上機(jī)摩爾數(shù)的要素。常規(guī)使用qPCR法和熒光計(jì)法（以Qubit^®常用）。

1）qPCR法

qPCR法使用特異性引物僅定量樣品中兩端接頭連接完整的文庫(kù)（即可測(cè)序的文庫(kù)），可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾，是目前業(yè)內(nèi)進(jìn)行文庫(kù)定量的金標(biāo)準(zhǔn)。使用qPCR法時(shí)，需要以不同濃度的已知長(zhǎng)度DNA的片段（常為452bp）作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)曲制作，進(jìn)而進(jìn)行文庫(kù)定量。

由于標(biāo)準(zhǔn)品與文庫(kù)的實(shí)際長(zhǎng)度可能不同，因此計(jì)算時(shí)，需要對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行校正。

原始文庫(kù)濃度（nM）= [452 bp /文庫(kù)平均長(zhǎng)度（bp）] × 稀釋文庫(kù)的濃度（pM）× 稀釋倍數(shù)/1000

一般情況下，理想的文庫(kù)濃度應(yīng)在10-100nM之間。如果文庫(kù)測(cè)定結(jié)果在100nM以上，表明文庫(kù)的PCR循環(huán)數(shù)過高，這可能會(huì)增加測(cè)序數(shù)據(jù)中的Duplicate rate，此時(shí)可以通過減低1個(gè)PCR循環(huán)數(shù)來獲得10-100nM之間的文庫(kù)。

為了獲得的定量結(jié)果，在使用qPCR方式進(jìn)行文庫(kù)定量時(shí)，建議遵循以下原則：

Ø  等量分裝qPCR Mix和DNA標(biāo)準(zhǔn)品，避免模板污染和反復(fù)凍融的影響

Ø  在進(jìn)行qPCR之前，將反應(yīng)體系配制區(qū)和模板制備區(qū)進(jìn)行物理隔離，并定時(shí)使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行擦拭清理。

Ø  待測(cè)樣本做梯度稀釋，并且同時(shí)做3個(gè)平行重復(fù)

Ø  檢查梯度稀釋液以及平行樣本具有一致性的可重復(fù)的測(cè)定值

Ø  檢查確定待測(cè)文庫(kù)Ct在標(biāo)準(zhǔn)曲線以內(nèi)時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算文庫(kù)濃度

2）熒光計(jì)法（Qubit^®, Picogreen）

Qubit^®是核酸和蛋白定量熒光儀，采用熒光染料檢測(cè)特定目標(biāo)分子的濃度，能夠?qū)?/span>DNA和RNA進(jìn)行定量。Picogreen是一種極為靈敏的熒光核酸染料，其僅在與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出熒光，且所產(chǎn)生的熒光與DNA濃度呈正比，是定量DNA文庫(kù)的zui常用染料。

由于染料與DNA雙鏈結(jié)合，但無法有效區(qū)分文庫(kù)雙鏈和其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)（如單端連接接頭產(chǎn)物或未連接接頭產(chǎn)物），所以相對(duì)qPCR法定量文庫(kù)來說，Qubit^®方法的度稍弱一些，但是Qubit^®出眾的簡(jiǎn)便性、靈敏度以及低成本使得Qubit^®成為測(cè)序?qū)嶒?yàn)室*的儀器之一。此外，Input DNA由于沒有添加接頭，是無法使用qPCR方式定量的，此時(shí)Qubit^®方法相對(duì)其他如Nanodrop等方法來說，是zui為的方法。

使用Qubit^®熒光計(jì)方法得到的文庫(kù)濃度以ng/μL為單位，而測(cè)序上機(jī)文庫(kù)以nM（nmol/L）為單位，因此測(cè)定值需要根據(jù)以下公式進(jìn)行換算：

文庫(kù)摩爾數(shù)（nM）≈ 文庫(kù)質(zhì)量(ng/μL)×10⁶/[660×文庫(kù)平均長(zhǎng)度（bp）]

3. 文庫(kù)污染物檢測(cè)

Nanodrop是檢測(cè)樣本污染物zui快的方法之一，能夠在包括紫外及可見光區(qū)域在內(nèi)的光譜范圍內(nèi)檢測(cè)污染物的吸光度信號(hào)，核酸污染物的常用參考標(biāo)準(zhǔn)是A260/280和A260/230。

理想文庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)是A260/280>1.8，A260/230>2.0，不在該范圍時(shí)，建議重新進(jìn)行文庫(kù)純化或者重新建庫(kù)，否則，可能造成文庫(kù)簇生成量少，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量差。

需要注意，不要使用Nanodrop做建庫(kù)過程中的DNA或RNA定量！

4. 相關(guān)產(chǎn)品

上海翊圣生物科技有限公司