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☆在完整的RNA和降解的RNA樣本中，檢測的基因的Ct值是穩(wěn)定的嗎？
☆如果基因表達(dá)差異倍數(shù)不大，與RNA降解有關(guān)嗎？
☆內(nèi)參基因的作用：降低RNA降解對qPCR的影響
☆引物的選擇：擴(kuò)增合適大小的目的片段
基因定量包含逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR，獲得高純度、降解程度低的RNA，對于其后的反轉(zhuǎn)、定量結(jié)果，自然是非常重要的。
一、RNA完整性（RNA integrity）
RNA的降解程度可根據(jù)RIN值來評定，該值由Aligent 2100儀器測定。將RNA完整性分為10級，用數(shù)字1、2、3……8、9、10表示。RIN值越接近10，RNA完整性越好；RIN值越接近1，RNA降解越嚴(yán)重。
就降解程度而言，來源于組織的RNA較細(xì)胞嚴(yán)重。RNA完整性與樣本的組成（內(nèi)源性RNase含量）、保存、處理過程（處理難易程度）、處理時間（處理速度）有關(guān)。較堅(jiān)硬、較難處理的樣本（如瘤胃、空腸），獲得的RNA的RIN值越小，且不同樣本間重復(fù)性差。
二、RNA發(fā)生降解后，qPCR定量的Ct值變大
Corpus luteum來源的RNA經(jīng)酶消化處理或紫外線照射，獲得不同降解程度的RNA。之后，對18S rRNA、28S rRNA、β-actin及IL-1β定量。
我們可以看到：
1、不論是高豐度表達(dá)基因（18S rRNA、28S rRNA、β-actin）或低豐度表達(dá)基因（IL-1β），RNA降解程度越高，Ct值越大；RNA完整性越好，Ct值越小。
2、RNA質(zhì)量越好，Ct值波動越小，qPCR實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性也越好。
三、RNA發(fā)生降解后，定量結(jié)果不可控
進(jìn)行基因表達(dá)量分析時，可通過選擇內(nèi)參基因嘗試消除樣本間模板量的差異。RNA的降解可認(rèn)為是RNA“穩(wěn)態(tài)”的變化，引入內(nèi)參基因校正樣本不同降解程度的差異。那么經(jīng)內(nèi)參（β-actin）校正后的基因（18S rRNA、28S rRNA、IL-1β）的qPCR檢測結(jié)果即△Ct值變化情況如何呢？
可以看出：1、內(nèi)參基因（β-actin）校正后，RNA降解前后，△Ct值變化較Ct值變化小。
2、經(jīng)內(nèi)參基因校正后，對于一些基因（28S rRNA），RNA降解前后，△Ct值依舊會出現(xiàn)“小的”變化。
因此，RNA模板發(fā)生降解，利用相對定量PCR可以定量基因表達(dá)的趨勢，而進(jìn)行定量需謹(jǐn)慎！因此，基因表達(dá)差異倍數(shù)不大時，需評估RNA質(zhì)量。
四、從RNA完整性角度解釋：qPCR定量，擴(kuò)增產(chǎn)物長度控制在70-250bp
RNA降解程度與qPCR擴(kuò)增基因的長度呈現(xiàn)一定的關(guān)系：70-250bp，RNA完整性越高，Ct值越小，呈現(xiàn)線性關(guān)系。而＞400bp，RNA完整性與Ct值之間無明顯相關(guān)性。因此，RNA模板發(fā)生部分降解，對于＞400bp以上的目的基因，無法利用相對定量進(jìn)行定性分析。
RNA發(fā)生降解，會影響qPCR的Ct值，導(dǎo)致定量數(shù)據(jù)的重復(fù)性差。即使使用內(nèi)參基因校正，依舊會造成定量結(jié)果出現(xiàn)誤差，不能反應(yīng)樣本間的基因表達(dá)量的差異。但是當(dāng)降解不嚴(yán)重時，還是可以用于基因的定性分析。
小編碼了這么多字，其實(shí)就是想說“作為模板的RNA，它的完整性對于做好qPCR實(shí)驗(yàn)很有意義”，畢竟RNA是容易降解的。
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