Exosome（外泌體）是由活細(xì)胞分泌的直徑約為30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)；參與細(xì)胞之間的交流，物質(zhì)的運(yùn)輸以及正常生理過程的維持，此外還與疾病的產(chǎn)生有關(guān)。

對(duì)分離的外泌體進(jìn)行體外標(biāo)記或活體示蹤，有助于對(duì)外泌體的功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究。目前對(duì)于外泌體的標(biāo)記方法有很多種，包括親脂性的染料和膜滲透型的化合物等。

下面小編就為大家羅列下近幾年文獻(xiàn)發(fā)表中有關(guān)外泌體染色的方法。

一、親脂性染料 :PKH-67（green）/PKH-26（red）

染料可以穩(wěn)定的與細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)結(jié)合并發(fā)出熒光，主要用于細(xì)胞體外標(biāo)記、體外細(xì)胞增殖研究以及體內(nèi)外的細(xì)胞失蹤研究。PKH67的體內(nèi)熒光半衰期為10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更長的半衰期，標(biāo)記在兔紅細(xì)胞上的PKH26半衰期長達(dá)100天以上。特別適用于體外增殖研究以及長期的體內(nèi)細(xì)胞跟蹤研究。

將PKH67標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞外泌體與b.End3 細(xì)胞共培養(yǎng)后的熒光圖

圖片引自：Xu B, Zhang Y, Du X-F, et al. Neurons secrete miR-132-containing exosomes to regulate brain vascular integrity. Cell Research. 2017;27(7):882-897.

二、親脂性羰花青染料（carbocyanine dyes）:DiI/DiD/DiO/DiR

DiI, DiO, DiD, DiR是一系列親脂性的熒光染料，可以用來染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)。這些環(huán)境敏感性熒光染料在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，當(dāng)與細(xì)胞膜結(jié)合后其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。且具有消光系數(shù)高、極性依賴性、激發(fā)態(tài)壽命短等特點(diǎn)。一旦進(jìn)入細(xì)胞膜后，可在整個(gè)細(xì)胞膜上擴(kuò)散，適宜濃度時(shí)可以使整個(gè)細(xì)胞膜染色。

下面小編整理了使用這類染料對(duì)外泌體進(jìn)行標(biāo)記的文獻(xiàn)。

DiI

將DiI標(biāo)記的外泌體注射入小鼠海馬齒狀回（DG）區(qū)，分別觀察第3、6和20天的熒光，對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)外泌體在皮質(zhì)層發(fā)生了很大的遷移。

圖片引自：Zheng T, Pu J, Chen Y, et al. Plasma Exosomes Spread and Cluster Around β-Amyloid Plaques in an Animal Model of Alzheimer’s Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 2017;9:12.

DiD

上圖顯示的是將DiD標(biāo)記的外泌體與PC12細(xì)胞孵育3H后，用共聚焦觀察的結(jié)果。

圖片引自：Tian T, Zhu YL, Zhou YY, Exosome uptake through clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis and mediating miR-21 delivery. J Biol Chem. 2014 Aug 8;289(32):22258-67

DiR

體內(nèi)靜脈注射DiR標(biāo)記的外泌體，24H后進(jìn)行成像觀察，結(jié)果如上圖所示。

圖片引自：Wiklander OP, Nordin JZ, O'Loughlin A, et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.J Extracell Vesicles. 2015 Apr 20;4:26316.

DiO

使用ExoChip-chambers捕獲不同樣品中的exosome，然后使用DiO進(jìn)行外泌體染色，通過觀察熒光的強(qiáng)弱對(duì)不同來源樣品中的外泌體進(jìn)行定量分析。

圖片引自：Kanwar SS, Dunlay CJ, Simeone DM, Nagrath S. Microfluidic device (ExoChip) for On-Chip isolation, quantification and characterization of circulating exosomes. Lab on a chip. 2014;14(11):1891-1900.

三、滲透型的化合物標(biāo)記法：CFSE/CFDA/Calcein-AM

1. CFSE：

羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯，常稱為 CFSE，可被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。 這種試劑沒有顏色和熒光，直至細(xì)胞內(nèi)的酯酶去除其醋酸鹽基團(tuán)，產(chǎn)生能發(fā)出明亮熒光的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯。琥珀酰亞胺酯與細(xì)胞內(nèi)氨基反應(yīng)，形成穩(wěn)定且能用醛固定劑固定的熒光偶聯(lián)物。

使用CFSE進(jìn)行標(biāo)記的外泌體可以用于后續(xù)FACS、NTA和顯微鏡觀察使用。

圖片引自：van der Vlist EJ1, Nolte-'t Hoen EN, Stoorvogel W, et.al.Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry，Nat Protoc. 2012 Jun 14;7(7):1311-26.

1. Calcein-AM：

在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團(tuán)，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。

上圖展示的是通過鈣黃綠素染色的方法對(duì)獲得的外泌體完整性進(jìn)行檢測。如果外泌體完整性很好，發(fā)出綠色熒光的鈣黃綠素就可以保留在外泌體中，反之，則會(huì)從外泌體中泄漏出來。

圖片引自：Warren D. Gray, Adam J. Mitchell, Charles D. Searles, An accurate, precise method for general labeling of extracellular vesicles, MethodsX. 2015; 2: 360–367.

四、利用外泌體表面的巰基（thiol group）對(duì)外泌體進(jìn)行標(biāo)記：

C5-maleimide-Alexa 488 / C5-maleimide-Alexa 633

上圖中左圖顯示的是maleimide-633標(biāo)記的外泌體與肺成纖維母細(xì)胞共培養(yǎng)的結(jié)果；右圖展示的是EV488標(biāo)記的外泌體與Hela細(xì)胞共培養(yǎng)的結(jié)果。

圖片引自：Roberts-Dalton HD1, Cocks A, Falcon-Perez JM,et al. Fluorescence labelling of extracellular vesicles using a novel thiol-based strategy for quantitative analysis of cellular delivery and intracellular traffic.Nanoscale. 2017 Sep 21;9(36):13693-13706.

五、通過物理的方法對(duì)外泌體進(jìn)行標(biāo)記：

1、放射性標(biāo)記物：⁹⁹mTc-HMPAO

     外泌體標(biāo)記示意圖：將⁹⁹mTc-HMPAO與外泌體進(jìn)行孵育，⁹⁹mTc-HMPAO進(jìn)入外泌體后被內(nèi)源的谷胱甘肽轉(zhuǎn)換成親水的形式，從而滯留在外泌體中，達(dá)到標(biāo)記的目的。右側(cè)是將標(biāo)記后的外泌體輸入小鼠體內(nèi)后觀察到的外泌體分布圖。

圖片引自：Hwang DW, Choi H, Jang SC, et al. Noninvasive imaging of radiolabeled exosome-mimetic nanovesicle using 99mTc-HMPAO. Scientific Reports. 2015;5:15636.

2、量子點(diǎn)微囊泡標(biāo)記：Ag2Se @錳量子點(diǎn)

Ag2Se @錳量子點(diǎn)一體化具有優(yōu)良的近紅外（NIR）熒光和磁共振（MR）成像能力，可用于MV體內(nèi)的高分辨率雙模式實(shí)時(shí)有效的標(biāo)記跟蹤。是一種低毒高靈敏、非侵入性的實(shí)時(shí)活體成像的方法。

Ag2Se @錳量子點(diǎn)是通過控制Mn+與Ag2Se納米晶體在80℃的NaOH溶液反應(yīng)制成，其具有約1.8納米的超小尺寸，良好的水分散性，高NIR熒光量子產(chǎn)率和12.87毫-1-1高縱向弛豫。超小尺寸使他們能夠通過電穿孔直接和有效地裝入的MV。該方法可以用于不同來源的微囊泡標(biāo)記，對(duì)微囊泡的不會(huì)有太多損傷。

上圖展示的是使用Ag2Se @錳量子點(diǎn)對(duì)巨型囊泡（MV）進(jìn)行標(biāo)記的方法

圖片引自： Jing-Ya Zhao, Gang Chen, Yi-Ping Gu, et al. Ultrasmall Magnetically Engineered AgSe Quantum Dots for Instant Efficient Labeling and Whole-Body High-Resolution Multimodal Real-Time Tracking of Cell-Derived Microvesicles. Journal of the American Chemical Society 2016 138 (6), 1893-1903

產(chǎn)品訂購：