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上新 | 熱穩(wěn)定、低宿主殘留的RNase HII來(lái)咯！

2023-12-4　　閱讀(65)

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上新 | 熱穩(wěn)定、低宿主殘留的RNase HII來(lái)咯！

 


RNase HII是一種核糖核酸內(nèi)切酶，識(shí)別DNA-rN-DNA/DNA雙鏈，在DNA摻入核糖核苷酸的位點(diǎn)進(jìn)行切割，但對(duì)單鏈RNA切割活性極低，對(duì)dsDNA、ssDNA無(wú)切割活性。RNase HII在50°C~75°C間具有活性，在70~75°C具有最佳活性。RNase HII作用時(shí)，在單核糖核苷酸殘基處從 5’端進(jìn)行切割，切割后產(chǎn)生一個(gè) 5′ 端磷酸基團(tuán)和一個(gè) 3′ 端羥基（圖1）。由于RNase HII具有在DNA摻入核糖核苷酸位點(diǎn)進(jìn)行單點(diǎn)切割且對(duì)dsDNA、ssDNA無(wú)切割活性的特性，RNase HII常用于啟動(dòng)反應(yīng)（引物激活并延伸）的“開關(guān)"，從而實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增，在RNase HII依賴性PCR(rhPCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等應(yīng)用廣泛。

 

圖1. RNase HII反應(yīng)原理示意圖

 

 

 

RNase HII應(yīng)用

 
01

依賴于Rnase HII的PCR (rhPCR)

 
 
rhPCR是在常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的基礎(chǔ)上增加了Rnase HII和封閉式可切割rhPCR引物，消除了反應(yīng)過(guò)程中引物二聚體的形成，極大減少了錯(cuò)誤擴(kuò)增的出現(xiàn)，顯著提升了反應(yīng)的特異性、靈敏度和重復(fù)性，在單核苷酸多態(tài)性（SNP）、基因分型、多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)、環(huán)境核酸檢測(cè)等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。

rhPCR引物是在高度保守的目標(biāo)寡核苷酸序列區(qū)域內(nèi)插入1段RNA堿基序列，形成DNA-RNA-DNA的堿基序列，并且該引物的3'-末端被化學(xué)基團(tuán)封阻，該引物未切割時(shí)無(wú)法正常延伸。Rnase HII可以特異性地水解DNA-rN-DNA/DNA雜合鏈中的RNA，但不能水解單鏈或雙鏈DNA或RNA中的磷酸二酯鍵。因此只有當(dāng)封閉引物與靶DNA互補(bǔ)時(shí)，Rnase HII才能使DNA-rN-DNA/DNA雜合鏈在RNA堿基的5'-側(cè)發(fā)生裂解，留下具有3'-羥基的DNA寡核苷酸，該3'-羥基DNA寡核苷酸能夠起到引物的作用，從而允許引物延伸。rhPCR利用Rnase HII的特異性作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA-rN-DNA/DNA雜合鏈的特異水解，從而實(shí)現(xiàn)引物的準(zhǔn)確延伸，提升了反應(yīng)的特異性。

 

圖2. rhPCR原理圖[1]

 

02

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)

 
 
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是一種簡(jiǎn)便、快速的基因擴(kuò)增方法，能在等溫條件下，短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。但由于在常溫配制過(guò)程中，DNA聚合酶已經(jīng)開始工作，形成非特異性的錯(cuò)配，容易產(chǎn)生少量錯(cuò)配和引物二聚體，這些輕微的污染都會(huì)造成假陽(yáng)性。

將RNase HII應(yīng)用于LAMP擴(kuò)增體系后，能有效解決LAMP技術(shù)的假陽(yáng)性問(wèn)題，為L(zhǎng)AMP技術(shù)更加廣泛的應(yīng)用于臨床診斷。如圖3所示，利用Rnase HII引物激活的LAMP方法(PA-LAMP)，當(dāng)引物與靶ssDNA配對(duì)時(shí)，Rnase HII酶特異性切割引物上的RNA，激活引物，從而允許引物延伸，實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增，有效減少體系中的假陽(yáng)性。

 

圖3. PA-LAMP原理示意圖[2]

 

 

翌圣RNase HⅡ

 
翌圣的RNase HII（Cat#14539）來(lái)源于深淵熱球菌 (Pyrococcus abyssi, P.a.)，由翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor™重組表達(dá)而來(lái)，無(wú)核酸外切酶、切口酶、RNase殘留，低宿主殘留，有效減少體系假陽(yáng)性。翌圣RNase HII極度耐熱，95°C孵化45 min后，活性幾乎不損失，可與rhPCR各反應(yīng)體系兼容，也適用于LAMP等。

 

 

部分?jǐn)?shù)據(jù)展示

 
01

E. coli基因組DNA殘留< 0.01copies/1 U

 
 
對(duì)不同批次的RNase H II (Cat#14539ES)進(jìn)行E. coli基因組DNA殘留檢測(cè)，結(jié)果顯示翌圣RNase H II宿主基因組DNA殘留遠(yuǎn)低于0.01 copies/1 U。

 

圖4. E. coli基因組DNA殘留檢測(cè)

 

02

95℃耐熱性測(cè)試

 
 

對(duì)RNase H II (Cat#14539ES)進(jìn)行95℃加熱0~45 min后，測(cè)試RNase HII的酶活結(jié)果，結(jié)果表明翌圣RNase HII加熱45 min后，酶活幾乎沒(méi)有損失。

 

圖5. 95℃耐熱測(cè)試

 

03

無(wú)核酸外切酶、切口酶、RNase殘留

 
 
將1 U不同批次的RNase HII分別與相應(yīng)的底物DNA/RNA在37℃孵育4 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，RNase HII無(wú)核酸外切酶、切口酶、RNase殘留。

 

圖6. 核酸外切酶、切口酶、RNase殘留檢測(cè)結(jié)果

 

 

 

相關(guān)產(chǎn)品推薦

 

產(chǎn)品應(yīng)用

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號(hào)

rhPCR、LAMP

RNase HII(2 U/μL)

14539ES

rhPCR

Hieff UNICON® Hotstart E-Taq DNA Polymerase, 5 U/μL

10726ES

RT-LAMP

Hieff® Bst Plus DNA Polymerase (40 U/μL)

14402ES

Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase 第三代耐熱逆轉(zhuǎn)錄酶

11111ES



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