【Chemical Science】雙功能熒光分子檢測富集5醛基尿嘧啶

*，一卵雙生的雙胞胎也不可能長得一模一樣，那么為什么具有相同的遺傳物質(zhì)的雙胞胎（DNA序列）卻在實(shí)際的生長過程中并非長得全部一樣呢（基因的表達(dá)）？表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域在這個(gè)方面有深入的探討。

DNA作為遺傳物質(zhì)在自然界的影響下會(huì)發(fā)生堿基修飾、突變甚至是缺失。DNA的甲基化和去甲基化就是生命過程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。在去甲基化的過程中胞嘧啶的修飾物會(huì)經(jīng)歷從正常胞嘧啶（C）到5hmC（5-羥甲基胞嘧）再到5fC（5-甲酰基胞嘧啶），進(jìn)一步再氧化為5caC（5-羧基胞嘧啶）的過程，而胸腺嘧啶也可以被TET酶氧化成5hmU。研究發(fā)現(xiàn)醛基修飾的尿嘧啶（5fU）可能在表觀遺傳學(xué)中也會(huì)起到一定的作用，例如在引入堿基錯(cuò)配，改變DNA的結(jié)構(gòu)等。通過化學(xué)手段，對(duì)生命體的有著特殊修飾的堿基的選擇性識(shí)別和富集是極其有必要的。

研究背景

2014年德國慕尼黑大學(xué)Thomas Carell教授報(bào)道了TET酶可以氧化胸腺嘧啶變成5羥甲基尿嘧啶（Nat. Chem. Biol. 2014, 10, 574），這一結(jié)果揭示了胸腺嘧啶（T）的氧化產(chǎn)物（5hmU、5fU、5caU）可能存在著一定的表觀學(xué)意義（T的氧化關(guān)系見圖1）。2015年劍橋大學(xué)Balasubramanian shanker篩選了一系列的生物素化的有機(jī)小分子用于5醛基尿嘧啶的富集（J.Am. Chem. Soc., 2015, 137, 9270），并于今年，將其用在針對(duì)真核生物的寄生蟲利什曼原蟲（eukaryote parasite Leishmania）的5羥甲基尿嘧啶的全基因組測序（Genome Biol，2017,18，23)）。

圖1 胸腺嘧啶（T）的氧化關(guān)系圖

傳統(tǒng)的5fU-DNA鏈的合成主要通過Pt催化-氧化鋨氧化-高碘酸鈉氧化，由于其使用的催化劑劇毒限購，對(duì)設(shè)備要求高，使得很長時(shí)間5fU-DNA合成沒有顯著的突破。2017年武漢大學(xué)報(bào)道了一個(gè)丙二醇保護(hù)的5fU固相合成DNA單體，并將其結(jié)合到了傳統(tǒng)的DNA固相合成中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)這一技術(shù)的突破（Nano Res., 2017, DOI:10.1007/s12274-017-1445-2.）。（圖2）

圖 2

研究思路

近日，學(xué)術(shù)期刊《Chemical Science》（IF=9.144）發(fā)表了武漢大學(xué)在這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)的成果。該研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成一個(gè)生物素化的含有鄰苯二胺結(jié)構(gòu)的萘酰亞胺探針，并將其用于熒光檢測在Hela細(xì)胞中經(jīng)過伽馬射線誘發(fā)產(chǎn)生的5fU，以及實(shí)現(xiàn)對(duì)5fU的選擇性富集。其中小分子的作用機(jī)理是通過鄰苯二胺中的氨基富裕的電子發(fā)生PET效應(yīng)，猝滅了萘酰亞胺的熒光。當(dāng)探針分子高選擇性的與5fU發(fā)生共價(jià)作用以后，PET效應(yīng)消失，熒光重新恢復(fù)，并且這個(gè)探針偶聯(lián)有生物素，可以在后期應(yīng)用于生物素-親合素系統(tǒng)(Biotin-Avidin—System,BAS)，實(shí)現(xiàn)對(duì)5fU的選擇性富集。（圖3）

圖3 基于PET熒光淬滅效應(yīng)選擇性富集熒光檢測的生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子

部分簡寫詞語的含義

5fU：5醛基尿嘧啶

5hmU：5羥甲基尿嘧啶

5caU：5羧基尿嘧啶

TET：Ten-eleven translocation，是生物體內(nèi)存在的一種α-酮戊二酸（α-KG）和2價(jià)Fe離子依賴的雙加氧酶。

光致電子轉(zhuǎn)移(PET)：光致電子轉(zhuǎn)移是指電子給體或電子受體受光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)的電子給體與電子受體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致熒光的淬滅過程。具體PET過程如下：在光激發(fā)下，具有電子給予能力的鍵合基團(tuán)能夠?qū)⑵涮幱趜ui高能級(jí)的電子轉(zhuǎn)入激發(fā)態(tài)下熒光基團(tuán)空出的電子軌道，使被光激發(fā)的電子無法直接躍遷到原基態(tài)軌道發(fā)射熒光，從而導(dǎo)致熒光的淬滅;當(dāng)鍵合基團(tuán)與底物結(jié)合后，降低了鍵合基團(tuán)的給電子能力，抑制了PET過程，熒光基團(tuán)中被光激發(fā)的電子可以直接躍遷回到原基態(tài)軌道，從而增強(qiáng)了的熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射。因此在未結(jié)合底物前，傳感器分子表現(xiàn)為熒光淬滅，一旦鍵合基團(tuán)與底物相結(jié)合，熒光基團(tuán)就會(huì)發(fā)射熒光。

生物素-親合素系統(tǒng)(Biotin-Avidin—System,BAS)：生物素－親合素系統(tǒng)（Biotin-Avidin—System,BAS）是70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。近年大量研究證實(shí)：生物素—親合素系統(tǒng)幾乎可與目前研究成功的各種標(biāo)記物結(jié)合。生物素與親和素之間高親合力的牢固結(jié)合以及多級(jí)放大效應(yīng)，使BAS免疫標(biāo)記和有關(guān)示蹤分析更加靈敏。它已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術(shù)。

研究結(jié)果

1、生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子對(duì)含有5fU-DNA鏈的選擇性反應(yīng)

研究人員首先嘗試了含有5fU的人工合成的DNA鏈，通過液相色譜，DNA凝膠電泳，熒光儀器以及聚合酶中止反應(yīng)證明了探針分子對(duì)5醛基尿嘧啶反應(yīng)的高選擇性（見圖4）。

圖4 生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子選擇性與5fU反應(yīng)

2、對(duì)伽馬射線處理Hela細(xì)胞的成像

作者將Hela細(xì)胞分成了三組，分別是進(jìn)行伽馬射線照射，不加化合物；不進(jìn)行伽馬射線照射，加化合物；以及伽馬射線處理后進(jìn)行化合物孵育。結(jié)果表明，探針分子與經(jīng)過伽馬射線氧化損傷以后的Hela細(xì)胞孵育后可以看到明顯的熒光響應(yīng)。（見圖5）

圖5 生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子對(duì)Hela細(xì)胞熒光顯色作用

3、探針分子對(duì)5fU富集

研究人員選用了實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)來對(duì)富集出來的5fU進(jìn)行定量，并且使用了上海翊圣生物科技有限公司的Hieff qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox )（貨號(hào)：11201ES08）這一優(yōu)勢產(chǎn)品。使用時(shí)，僅需在擴(kuò)增體系中加入模板和引物即可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，大大簡化操作過程，縮短操作時(shí)間，降低污染幾率。

該產(chǎn)品采用的DNA聚合酶配體可以隨溫度變化，實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)DNA聚合酶活性。配方添加了可有效抑制非特異性PCR擴(kuò)增因子與促進(jìn)PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率的因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的線性關(guān)系。線性關(guān)系見圖6。

圖6.新貴品牌Yeasen Hieff^TM qPCR SYBR® Green Master Mix qPCR線性定量的結(jié)果

文章小結(jié)

創(chuàng)建了一個(gè)生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子，不僅可以在生理?xiàng)l件下的熒光標(biāo)記5fU，還能對(duì)其進(jìn)行選擇性的富集。這一策略可以應(yīng)用于伽馬射線處理以后的Hela細(xì)胞中，也具有用來研究整個(gè)基因組修飾堿基含量的潛能。設(shè)計(jì)針對(duì)5fU檢測的化合物的策略可能適用于其他含有鄰苯二胺猝滅的熒光基團(tuán)。

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目前兩款產(chǎn)品均在*期間

產(chǎn)品信息：

活動(dòng)內(nèi)容：其中，UNICON^TM為升級(jí)版產(chǎn)品，特異性和靈敏度更高，更適合低濃度模板擴(kuò)增。

活動(dòng)條款：

1.活動(dòng)時(shí)間：2017.4.10-2017.6.30

2.本活動(dòng)可與“整裝待發(fā) 翊起GO”活動(dòng)疊加參與；

3.本活動(dòng)zui終解釋權(quán)歸上海翊圣生物所有。