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不讓您寶貴的克隆留下“疤痕”！
提起傳統(tǒng)酶切連接克隆或載體構(gòu)建，什么讓大家苦不堪言？
小A：每次都要糾結(jié)于各種限制性內(nèi)切酶的選擇。 
小B：操作步驟繁瑣，耗時(shí)長，至少需三四天才能完成。
小C：每次只能克隆1個(gè)目的片段。
小D：片段結(jié)合位置上有時(shí)會(huì)留下“疤痕”。
······
忘記苦難，今天小編給大家介紹一種新的克隆方法—一步法同源重組技術(shù)，帶你們脫離苦惱！
一步法同源重組是一種利用同源重組的原理，進(jìn)行無縫克隆的技術(shù)。該技術(shù)無需考慮酶切位點(diǎn)，幾乎適用于任何載體與任何片段的定向克隆。操作過程簡(jiǎn)單快速，只需50℃，20min即可完成反應(yīng)。勁爆的是，多個(gè)片段也可以同時(shí)克隆哦！
激動(dòng)寶寶小C：如此厲害，是如何做到呢？
【秘】一步法同源重組的關(guān)鍵在于重組酶。它由三種酶混合而成。分別是外切酶，DNA聚合酶和連接酶。
外切酶活性：該酶能沿著5’→3’方向，降解雙鏈DNA，從而產(chǎn)生黏性末端，這樣便于與另外的同源末端進(jìn)行配對(duì)結(jié)合（兩個(gè)同源序列通過外切酶的切割，能產(chǎn)生幾乎一致的黏性末端）。
DNA聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保證將每一個(gè)片段的5’末端都降解成一樣長的黏性末端，同源末端退火配對(duì)后，極可能存在缺失的堿基。此時(shí)需要借助DNA聚合酶進(jìn)行修復(fù)缺口。
連接酶活性：催化形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補(bǔ)齊，實(shí)現(xiàn)無“疤痕”拼接，即無縫克隆。
好奇寶寶小D：外切酶降解雙鏈DNA多長呢？是否會(huì)把雙鏈DNA切割成單鏈導(dǎo)致無法進(jìn)行片段重組呢？
莫擔(dān)心，自有妙招！的重組反應(yīng)溫度是50℃，遠(yuǎn)高于外切酶的zui適溫度（37℃），此外，外切酶的含量較低，故重組反應(yīng)體系中很快會(huì)失去外切酶活性。對(duì)于200bp以上的雙鏈DNA-片段都是*不用擔(dān)心的，當(dāng)然，幾十bp的小片段是不適合同源重組的。
心急寶寶小B：這么牛掰的，快給我們講講怎么操作吧。
步驟1：制備載體
需將線性化載體的制備好，既可以選擇酶切，也可以選擇PCR的方式制備線性化載體。
步驟2：設(shè)計(jì)目的片段引物
在目的片段上下游引物的5’端引入15-25bp左右載體末端同源序列。
步驟3：擴(kuò)增目的片段
通過PCR的方法，使目的片段的兩端加上了與載體末端相應(yīng)的同源序列。
步驟4：重組反應(yīng)
按比例混合線性化載體和目的片段，50℃反應(yīng)20 min。
步驟5：轉(zhuǎn)化，鑒定
將重組產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化后涂平板，挑取克隆進(jìn)行陽性鑒定。
機(jī)智寶寶小A：有啥應(yīng)用呢？
可以應(yīng)用于定點(diǎn)突變，CRISPR，構(gòu)建多順反子表達(dá)載體等等。
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