分子克隆知多少

*個(gè)人造生命細(xì)胞——Mycoplasma mycoides

2010年，借助于已知的基因組序列信息，偉大的JCVI研究所（J. Craig Venter Institute）的偉大的合成生物學(xué)博士Daniel Gibson及其同事精心設(shè)計(jì)、合成并巧妙組裝出完整的Mycoplasma mycoides基因組（大小為1.08Mbp），并將之轉(zhuǎn)移到不含任何基因組的受體細(xì)胞（Mycoplasma capricolum）中，進(jìn)而人造出*個(gè)生命細(xì)胞——Mycoplasma mycoides細(xì)胞。令人驚奇的是，新的生命細(xì)胞表現(xiàn)出預(yù)期的表型特征，且具備自主復(fù)制的能力。需要特別提出的是：用于片段組裝的分子克隆技術(shù)及酵母同源重組技術(shù)功不可沒(méi)。

（圖1.The assembly of a synthetic M. mycoides genome in yeast. DOI: 10.1126/science.1190719）

與PCR、qPCR等技術(shù)一樣，作為分子實(shí)驗(yàn)室*手段，分子克隆技術(shù)被廣泛用于多樣的基因功能研究。所謂分子克隆指的是在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)并獲得持續(xù)穩(wěn)定增殖能力和表達(dá)（現(xiàn)代分子生物學(xué)，第3版）。

分子克隆方法大全

分子克隆技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷3個(gè)階段，*階段為經(jīng)典的T4 DNA連接酶介導(dǎo)的TA克隆及粘性末端克隆，第二階段為基于DNA修飾酶的LIC系列克隆，第三階段為基于DNA重組酶的Gateway克隆及一步法克隆（該方法與Daniel Gibson等所發(fā)明的技術(shù)原理相同，原理詳見(jiàn)后面部分）。

分子克隆技術(shù)發(fā)展歷程

常見(jiàn)的分子克隆類(lèi)型

1.基于T4 DNA連接酶的克隆

本系列克隆使用的酶類(lèi)為：T4 DNA連接酶（和限制性?xún)?nèi)切酶）。

T4 DNA連接酶作用：可以催化目的片段和載體zui后一位堿基上的5’磷酸基團(tuán)和3’羥基形成磷酸二酯鍵，以實(shí)現(xiàn)將目的片段和載體連接成環(huán)狀質(zhì)粒。

限制性?xún)?nèi)切酶作用：可以對(duì)目的片段和載體識(shí)別并切割出相同的粘性末端，用于堿基互補(bǔ)配對(duì)。

根據(jù)是否使用限制性?xún)?nèi)切酶，可分為平末端克隆/TA克隆和粘性末端克隆。

1.1平末端克隆/TA克隆

該方法可用于目的基因的測(cè)序或保存，或用于文庫(kù)構(gòu)建等。其克隆原理和過(guò)程如圖所示。

1.2粘性末端克隆

zui為傳統(tǒng)、zui為經(jīng)典的克隆方法，現(xiàn)在依舊被眾多實(shí)驗(yàn)室廣泛使用。該克隆方法可用于構(gòu)建表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒等。

2.基于DNA修飾酶的克隆方法

今天所介紹的該系列克隆方法依賴(lài)的酶為：T4 DNA聚合酶。

T4 DNA聚合酶的作用：具有3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性。缺乏dNTP時(shí)，表現(xiàn)為3'→5'核酸外切酶活性，切割目的基因和載體，產(chǎn)生單鏈的DNA粘性末端；加入某一單獨(dú)dNTP，3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性平衡，摻入與切割動(dòng)態(tài)平衡，切割終止。

因此，T4 DNA聚合酶為基礎(chǔ)的克隆方法的關(guān)鍵是目的基因和載體間需要有一定數(shù)量的重疊序列。

2.1 LIC克隆法

通過(guò)T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切活性分別處理目的基因和載體的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生12nt的5'突出互補(bǔ)末端，利用突出的互補(bǔ)末端之間的退火進(jìn)行基因克隆。12nt為人為額外添加。

克隆過(guò)程：

1、用5'端帶有重疊序列的特異性引物分別擴(kuò)增目的DNA基因和載體，獲得帶有重疊序列的目的基因和線(xiàn)性化質(zhì)粒；

2、使用T4 DNA聚合酶的3'→5'核酸外切酶活性分別消化PCR擴(kuò)增得到的目的基因和載體；

3、產(chǎn)生粘性末端后，添加某一成分dNTP，終止切割；

4、將帶有重疊序列的兩個(gè)片段進(jìn)行退火，就形成了帶有切口的環(huán)狀質(zhì)粒；

5、轉(zhuǎn)化后，大腸桿菌內(nèi)的修復(fù)機(jī)制修復(fù)損傷的DNA分子，經(jīng)過(guò)復(fù)制得到大量目的質(zhì)粒。

2.2 SLIC克隆法

與LIC克隆不同，SLIC克隆中目的基因和載體的重疊序列使用的是載體末端序列，因此SLIC克隆為無(wú)縫克隆。

克隆過(guò)程：

1、用帶有重疊序列的特異性引物擴(kuò)增目的基因，用限制性?xún)?nèi)切酶或PCR擴(kuò)增得到線(xiàn)性化質(zhì)粒；

2、T4 DNA聚合酶分別處理PCR擴(kuò)增得到的目的基因和線(xiàn)性化質(zhì)粒一段時(shí)間；

3、產(chǎn)生粘性末端后，添加某一單獨(dú)dNTP終止反應(yīng)，從而得到含有一段粘性末端的目的基因和線(xiàn)性化質(zhì)粒；

4、然后目的基因和線(xiàn)性化質(zhì)粒經(jīng)過(guò)變性、退火，得到帶有“缺口”的環(huán)狀質(zhì)粒；

5、轉(zhuǎn)化后，經(jīng)過(guò)大腸桿菌體內(nèi)修復(fù)機(jī)制，獲得完整環(huán)狀質(zhì)粒。

3.基于重組酶的克隆方法

今天介紹的該系列克隆方法雖同為重組法克隆，但酶的性質(zhì)不同，故分開(kāi)論述。

3.1 Gateway克隆法——實(shí)現(xiàn)基因在不同類(lèi)型載體間“穿梭”

該技術(shù)依賴(lài)的酶：λ整合酶Int、λ切除酶Xis、大腸桿菌IHF因子。

該技術(shù)需要四個(gè)特異性重組位點(diǎn)（attB、aatP、attL、attR），引導(dǎo)發(fā)生兩個(gè)特異性重組反應(yīng)（BP反應(yīng)和LR反應(yīng)）。

BP反應(yīng)：將目的基因克隆進(jìn)入入門(mén)質(zhì)粒。使用到的酶為Int和IHF。

LR反應(yīng)：將入門(mén)質(zhì)粒中的目的基因轉(zhuǎn)移到終載體中，獲得表達(dá)載體。使用到的酶為Int、IHF及Xis。

終載體若帶有attR位點(diǎn)，則帶有attL位點(diǎn)的入門(mén)克隆便可以與之發(fā)生LR反應(yīng)，進(jìn)而將入門(mén)克隆的目的基因轉(zhuǎn)移到不同類(lèi)型的終載體中。

3.2 一步法克隆——Daniel Gibson發(fā)明的分子克隆方法的“簡(jiǎn)版”

該技術(shù)依賴(lài)的“重組酶”：核酸外切酶、高保真DNA聚合酶及連接酶。

該技術(shù)的基礎(chǔ)同樣為：目的基因和載體之間需要15-20bp的重疊序列。

前文提到的LIC、SLIC等方法都要“粘性”末端暴露、添加dNTP終止和“粘性”末端退火等過(guò)程，操作繁瑣。而一步法克隆能夠在一個(gè)反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)“粘性”末端暴露、退火及片段的組裝。

3.5 TOPO克隆——zui快速、的克隆

Topo克隆技術(shù)依賴(lài)的酶為：兼具內(nèi)切酶活性與連接酶活性的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ。

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的作用：識(shí)別特定序列位點(diǎn)（CCCTT），并在2min內(nèi)對(duì)位點(diǎn)處完成80%的酶切連接反應(yīng)。

因此，Topo克隆反應(yīng)僅需2-5min完成。Topo克隆技術(shù)是潛力的克隆技術(shù)。

4.其他克隆方法

不同克隆方法的聯(lián)合使用，可實(shí)現(xiàn)快速的克隆。如使用一步法克隆將目的基因克隆進(jìn)入入門(mén)載體后，與Gateway克隆結(jié)合可實(shí)現(xiàn)目的基因在不同終載體中的穿梭。同理，使用Topo克隆與Gateway克隆聯(lián)合亦可達(dá)到相同目的。

選擇*的克隆方法

HB170904