產(chǎn)品描述

5-BrdU 溴化去氧尿苷目前常用的細胞增殖標(biāo)記物有4種，DNA聚合酶α（DNA polymerase α），增殖細胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA），Ki-67和5-溴脫氧尿嘧|啶核苷（Brdu）。其中Brdu為組織細胞非內(nèi)源性表達存在，應(yīng)用相對較廣。Brdu，也稱為溴化去氧尿苷，一種合成的胸苷類似物，在S期可替代胸腺嘧啶核苷選擇性結(jié)合到細胞DNA中。從而檢測細胞DNA合成和標(biāo)記細胞分裂，凋亡等行為。在遺傳研究中Brdu可通過活體注射或細胞培養(yǎng)加載，然后使用抗Brdu的單克隆抗體進行特異性標(biāo)記，ICC或IHC法染色法顯示增殖細胞。另外，還能同時結(jié)合其它細胞標(biāo)記物，雙重染色，來判斷增殖細胞的種類，增殖速度等，對研究細胞動力學(xué)有著重要意義。

產(chǎn)品性質(zhì)

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃干燥保存，2年有效。

操作步驟

1.Brdu儲存液的準備
用1X DPBS充分溶解適量的Brdu配置10 mg/mL的母液，過濾除菌后，按照0.5mL/管的量分裝放在-20°C或者-80°C長期保存，避免反復(fù)凍融。Brdu儲存液再融化后，4°C可穩(wěn)定存放一周。
2.體內(nèi)Brdu標(biāo)記

1）腹腔注射法（常用）：無菌的10 mg/mL（溶于DPBS）適合用于體內(nèi)注射用。按照100-200 μL（1-2 mg） Brdu的量腹腔注射到小鼠體內(nèi)。注意：最短在注射后0.5 h后在小腸，胸腺和骨髓瘤處就能檢測到Brdu。而一般在注射后24 h內(nèi)幾乎所有組織都能檢測到Brdu。這個時間可能對于一些快速分化的組織如小腸來說有些久。

2）根據(jù)自身的實驗體系，在合適的時間點處死動物，摘除待研究的組織。使用冰凍切片或者石蠟包埋的方法進行組織處理和切片制備。然后進入后續(xù)的IHC染色步驟。

3.體外Brdu標(biāo)記（培養(yǎng)原代細胞或者細胞系）

注：總的來說，10 μM Brdu（稀釋于培養(yǎng)液）是一個比較合適的方法用來標(biāo)記不同物種來源的原代細胞或細胞系。當(dāng)然，建議針對具體的實驗體系優(yōu)化方法。

1）在96孔板上按標(biāo)準步驟進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)時間一般為1-72 h；

2）Brdu工作液的準備：用組織細胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1mM Brdu工作液。然后取10 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL組織培養(yǎng)液即得到最終工作液。37°C溫?zé)帷?/span>

3）按100 μL/孔Brdu工作液的量進行細胞標(biāo)記，37°C孵育60 min~過夜。同時設(shè)置非Brdu標(biāo)記的細胞作為陰性對照。注意：最佳的孵育時間取決于細胞增殖速度以及需要達到的實驗?zāi)康?。比如，對于快速增殖細胞（如HL-60）有效孵育時間為30-45 min；對于原代細胞（如未受外源刺激培養(yǎng)的外周血淋巴細胞）孵育時間可能需要24 h。細胞密度最好不要超過2x106 cells/mL。

4）制備單細胞層玻片，使用以下任何一種方法：

a.細胞離心涂片（cytospin）制備：使用細胞離|心涂片機，將100 μL標(biāo)記好的細胞（濃度為：1-2 x106 cells/mL）直接離心到干凈，無脂肪，poly-L-lysin包被的玻片上，風(fēng)干。

b.細胞涂片（cell-smear）制備：取一小滴標(biāo)記好的細胞懸液于干凈，無脂肪，poly-L-lysin包被玻片的一端，然后用第二個干凈玻片將其均勻涂布成一薄層。室溫風(fēng)干。

5）將玻片置于70%冰乙醇放在-20°C下固定20-30 min。

6）PBS清洗細胞3次，每次5 min。

7）加入1.5M HCl中室溫孵育30 min。注意：DNA的變性對于Brdu染色的成功至關(guān)重要。

8）吸去HCl，PBS清洗2次，每次5 min。

9）進入后續(xù)ICC染色步驟。

4. 體外Brdu標(biāo)記（組織薄片）

1）Brdu工作液的準備：用組織細胞培養(yǎng)液按照1:30的比例稀釋儲存液得到1 mM Brdu工作液。然后取10 -20 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL組織培養(yǎng)液即得到最終工作液。確保有足夠的工作液（37°C溫?zé)幔?span style="color: rgb(60, 80, 108); font-family: 思源雅黑, SimSun; background-color: rgb(255, 255, 255);">全部浸泡組織。

2）用手|術(shù)刀或者鋒利的刀片將組織切割成約1 mm厚，2 mm2大小的薄片。建議在溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基內(nèi)進行切片，利于維持組織的活力。

3）轉(zhuǎn)移組織薄片至預(yù)裝有10 mL Brdu標(biāo)記液的15 mL離心管內(nèi)。于37°，CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育需要的時間。孵育時間可變，取決于組織薄片類型以及需要達到的實驗?zāi)康模ǔＳ玫臑?-4 h）。直接丟棄未用完的標(biāo)記液。

4）37°C PBS清洗組織薄片，每次5 min。

5）使用標(biāo)準的冰凍切片或者石蠟包埋切片的方法固定組織。

HB210525