產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit是基于Hieff Clone™快速克隆技術(shù)的定點(diǎn)突變系統(tǒng)。使用本試劑盒，目標(biāo)質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化、Hieff Clone™重組環(huán)化后直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化即可完成定點(diǎn)突變。該試劑盒由兩個(gè)模塊組成：Hieff® II Pfu DNA Polymerase擴(kuò)增模塊和Hieff Clone®快速克隆模塊。Hieff® II Pfu DNA Polymerase超高的保真度顯著降低了擴(kuò)增過程中引入新突變的可能性，其長片段擴(kuò)增能力，廣泛適用于長度小于20 kb的任何質(zhì)粒擴(kuò)增。Hieff Clone®快速克隆系統(tǒng)利用高效的同源重組反應(yīng)替代傳統(tǒng)的退火成環(huán)反應(yīng)。因此使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit進(jìn)行DNA定點(diǎn)突變時(shí)，引物設(shè)計(jì)更加靈活，且擴(kuò)增反應(yīng)不再需要以線性方式進(jìn)行，極大減少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的*降解。Hieff Clone®技術(shù)可以高效完成兩個(gè)PCR產(chǎn)物的無縫拼接，因此該試劑盒還能以單次擴(kuò)增的方式對(duì)目標(biāo)質(zhì)粒上不連續(xù)的兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行突變。

Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit中的重組酶Exnase經(jīng)過優(yōu)化，專門針對(duì)單堿基、不連續(xù)雙堿基定點(diǎn)突變。此外，如擴(kuò)增產(chǎn)物特異，其DpnI消化產(chǎn)物可不進(jìn)行DNA純化而直接用于重組反應(yīng)。高度優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液、快捷的操作流程以及*的成功率，使得Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit成為DNA定點(diǎn)突變試劑盒。

應(yīng)用范圍

DNA定點(diǎn)突變

注：如使用本品對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變，請(qǐng)使用甲基化酶無缺陷的宿主菌 (例如Top    ⑩、DH5α、JM109)擴(kuò)增原始質(zhì)粒！

產(chǎn)品組成

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。產(chǎn)品-20℃保存。有效期1年。

單堿基（或連續(xù)多堿基）定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)流程概覽（圖一）

圖一：使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit進(jìn)行單堿基（或連續(xù)多堿基）定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)流程

1. 引物設(shè)計(jì)

向質(zhì)粒引入單堿基或連續(xù)多堿基定點(diǎn)突變，只需設(shè)計(jì)一對(duì)引物將質(zhì)粒進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增即可。引物設(shè)計(jì)基本原則為：正反向擴(kuò)增引物5’端包含15-21 bp反向互補(bǔ)區(qū)域（GC含量40%-60%為佳），各引物非互補(bǔ)區(qū)域長度至少為15 bp（待突變位點(diǎn)至引物3’端區(qū)域Tm值高于60℃為佳）。所需引入突變可以包含在互補(bǔ)區(qū)域內(nèi) (需要兩條引物上均引入點(diǎn)突變)，也可以包含在任一條引物的非互補(bǔ)區(qū)域 (只需在一條引物上引入點(diǎn)突變)，請(qǐng)勿將突變位點(diǎn)置于引物末端。以向pUC18引入單堿基突變?yōu)槔?，引物設(shè)計(jì)具體方案如圖二所示。

 圖二：向質(zhì)粒引入單堿基（或連續(xù)多堿基）定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)示意圖

注：計(jì)算引物Tm值時(shí)，應(yīng)計(jì)算待突變位點(diǎn)至引物3’端這一區(qū)域內(nèi)的堿基，調(diào)整引物長度使這一段Tm值高于60℃，待突變位點(diǎn)至引物5’端區(qū)域內(nèi)的堿基不應(yīng)參與計(jì)算。

2. 目標(biāo)質(zhì)粒擴(kuò)增

2.1 配制PCR反應(yīng)體系
反應(yīng)各組分解凍后請(qǐng)充分搖勻，使用完畢后及時(shí)放回-20℃。2×Hieff® II PCR buffer請(qǐng)勿長時(shí)間敞口放置。
為了增加擴(kuò)增特異性，反應(yīng)體系配制過程請(qǐng)于冰水浴中進(jìn)行。為了防止Hieff® II Pfu DNA Polymerase的校對(duì)活性降解引物，請(qǐng)將聚合酶最后加入反應(yīng)體系中。

a. 請(qǐng)勿使用dUTP和帶有尿嘧啶的引物或模板。

b. 在質(zhì)粒能正常擴(kuò)增的前提下，應(yīng)盡量減少質(zhì)粒模板使用量，推薦使用≤1 ng新鮮提取的質(zhì)粒做模板。

c. 推薦的酶的終濃度為1 U/50 μl反應(yīng)?？蓪ieff® II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之間進(jìn)行優(yōu)化，但不要超過2 U/50 μl，尤其當(dāng)擴(kuò)增子長度大于5 kb時(shí)。

2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

推薦PCR反應(yīng)條件：

a. 對(duì)于大多數(shù)質(zhì)粒，變性溫度使用95℃即可。

b. Hieff® II Pfu DNA Polymerase能夠促進(jìn)模板和引物高效退火。一般來說，退火溫度設(shè)置為引物Tm值即可。如果需要，可以建立一個(gè)溫度梯度反應(yīng)去尋找引物模板結(jié)合的最適溫度。退火時(shí)間太長可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物在膠上呈現(xiàn)彌散狀。

c. 對(duì)于大多數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，延伸過程可在72℃進(jìn)行。長的延伸時(shí)間有助于提高擴(kuò)增產(chǎn)量。

d. 為了防止擴(kuò)增過程中引入非目標(biāo)突變，強(qiáng)烈建議擴(kuò)增循環(huán)數(shù)≤35。如果擴(kuò)增效率良好的話，推薦擴(kuò)增循環(huán)數(shù)≤30。

反應(yīng)結(jié)束后取少量擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。如目標(biāo)質(zhì)粒正確擴(kuò)增，則可進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。

3. 擴(kuò)增產(chǎn)物DpnI消化，去除甲基化模板質(zhì)粒
因上述擴(kuò)增產(chǎn)物中包含原始模板質(zhì)粒，為防止其在轉(zhuǎn)化后形成假陽性轉(zhuǎn)化子，必須在進(jìn)行重組環(huán)化之前進(jìn)行DpnI消化。

推薦反應(yīng)體系如下：

輕輕吹打混勻后，將上述反應(yīng)體系置于37℃恒溫反應(yīng)1～2小時(shí)。如產(chǎn)物擴(kuò)增特異，產(chǎn)物條帶單一，DpnI消化產(chǎn)物無需純化，可直接用于后續(xù)重組反應(yīng)。如擴(kuò)增不特異，DpnI消化結(jié)束后應(yīng)膠回收純化目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。

4. 重組反應(yīng)

4.1 配制重組反應(yīng)體系

正反向擴(kuò)增引物5’端包含*反向互補(bǔ)的一段序列，因此在Exnase催化下擴(kuò)增產(chǎn)物5’末端和3’末端可以發(fā)生同源重組，完成擴(kuò)增產(chǎn)物環(huán)化過程。于冰水浴中，將下列組分依次加到無菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎將液體粘在管壁，請(qǐng)務(wù)必通過短暫離心使其沉入管底。體系配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，避免產(chǎn)生氣泡 (請(qǐng)勿劇烈震蕩或者渦旋混勻)。

單點(diǎn)突變重組反應(yīng)體系最適DNA使用量為0.03 pmol。該摩爾數(shù)對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計(jì)算獲得：

DpnI消化產(chǎn)物最適使用量 = [0.02 × 目標(biāo)質(zhì)粒堿基對(duì)數(shù)] ng (0.03 pmol)

例如，向長度為5 kb的目標(biāo)質(zhì)粒引入單點(diǎn)突變，DpnI消化產(chǎn)物最適使用量應(yīng)為：0.02 ×5000 = 100 ng。

注：DNA量太多或者太少都將降低環(huán)化效率。請(qǐng)務(wù)必通過瓊脂糖電泳預(yù)先確認(rèn)DNA濃度，盡量嚴(yán)格按照推薦量配制反應(yīng)體系。當(dāng)DpnI消化產(chǎn)物最適使用量計(jì)算值不足50 ng或者超過400 ng時(shí)，加入50ng或400 ng即可。DpnI消化產(chǎn)物不純化直接用于重組反應(yīng)時(shí)，使用量不應(yīng)超過反應(yīng)總體積的1/5，即4μl。

4.2 重組反應(yīng)

1） 將上述體系置于50℃反應(yīng) 20 min。

2） 待反應(yīng)完成后，立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻。

3） 之后，反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化；也可儲(chǔ)存于-20℃，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化。

5. 反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板、克隆鑒定

1） 取10 μl冷卻反應(yīng)液，加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。

2） 42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2 min。

3） 加入900 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10min充分復(fù)蘇。

4） 37℃，200rpm-250rpm，搖菌45 min。

5） 取100 μl菌液均勻涂布在含有適當(dāng)抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

注: 我們推薦您使用轉(zhuǎn)化效率>108 cfu/μg的感受態(tài)細(xì)胞。如果感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率<108 cfu/μg (例如用CaCl2法新鮮制備的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率通常在106-107 cfu/μg之間)，請(qǐng)將培養(yǎng)菌液在5,000 rpm離心3 min收集菌體，用100 μl LB培養(yǎng)基重懸后全部涂板。

不連續(xù)雙堿基定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)方案 (兩突變位點(diǎn)相距超過50 bp)

實(shí)驗(yàn)流程概覽（圖三）

  圖三：使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit進(jìn)行不連續(xù)雙堿基定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)流程

1. 引物設(shè)計(jì)

向質(zhì)粒兩個(gè)不連續(xù)位點(diǎn)引入不連續(xù)雙堿基定點(diǎn)突變，需要設(shè)計(jì)兩對(duì)引物將質(zhì)粒分為兩段進(jìn)行擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)基本原則為：在每個(gè)待突變位點(diǎn)處設(shè)計(jì)部分反向互補(bǔ)的擴(kuò)增引物對(duì)。每對(duì)正反向引物5’端包含15-21 bp反向互補(bǔ)區(qū)域。所需引入突變可以包含在互補(bǔ)區(qū)域內(nèi)(需要兩條引物上均引入點(diǎn)突變)，也可以包含在任一條引物的非互補(bǔ)區(qū)域(只需在一條引物上引入點(diǎn)突變)，請(qǐng)勿將突變位點(diǎn)置于引物末端。以向pUC18引入雙堿基突變?yōu)槔?，引物設(shè)計(jì)具體方案如圖四所示。

圖四：向質(zhì)粒引入不連續(xù)雙堿基定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)示意圖

注：計(jì)算引物Tm值時(shí)，應(yīng)計(jì)算待突變位點(diǎn)至引物3’端這一區(qū)域內(nèi)的堿基，調(diào)整引物長度使這一段Tm值高于60℃，待突變位點(diǎn)至引物5’端區(qū)域內(nèi)的堿基不應(yīng)參與計(jì)算。

2. 目標(biāo)質(zhì)粒擴(kuò)增

以待突變位點(diǎn)A、B為界，將質(zhì)粒分為AB段和BA段。使用Hieff™ II Pfu DNA Polymerase對(duì)AB段和BA段分別進(jìn)行擴(kuò)增。AB段擴(kuò)增引物對(duì)為：待突變位點(diǎn)A正向擴(kuò)增引物和待突變位點(diǎn)B反向擴(kuò)增引物；BA段擴(kuò)增引物對(duì)為：待突變位點(diǎn)B正向擴(kuò)增引物和待突變位點(diǎn)A反向擴(kuò)增引物。

2.1 配制PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)各組分解凍后請(qǐng)充分搖勻，使用完畢后及時(shí)放回-20℃。2×Hieff® II PCR buffer請(qǐng)勿長時(shí)間敞口放置。為了增加擴(kuò)增特異性，反應(yīng)體系配制過程請(qǐng)于冰水浴中進(jìn)行。為了防止Hieff® II Pfu DNA Polymerase的校對(duì)活性降解引物，請(qǐng)將聚合酶最后加入反應(yīng)體系中。
推薦反應(yīng)體系如下：

a. 請(qǐng)勿使用dUTP和帶有尿嘧啶的引物或模板。

b. 在各片段能正常擴(kuò)增的前提下，應(yīng)盡量減少質(zhì)粒模板使用量，推薦使用≤1 ng新鮮提取的質(zhì)粒做模板。

c. 推薦的酶的終濃度為1 U/50 μl反應(yīng)?？蓪ieff® II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之間進(jìn)行優(yōu)化，但不要超過2 U/50 μl，尤其當(dāng)擴(kuò)增子長度大于5 kb時(shí)。

2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

推薦PCR反應(yīng)條件：

a. 對(duì)于大多數(shù)質(zhì)粒，變性溫度使用95℃即可。對(duì)于超過 15 kb的擴(kuò)增子，變性溫度降低至92℃可以提高擴(kuò)增效率。

b. Hieff® II Pfu DNA Polymerase能夠促進(jìn)模板和引物高效退火。一般來說，退火溫度設(shè)置為引物Tm值即可。如果需要，可以建立一個(gè)溫度梯度反應(yīng)去尋找引物模板結(jié)合的最適溫度。退火時(shí)間太長可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物在膠上呈現(xiàn)彌散狀。

c. 對(duì)于大多數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，延伸過程可在72℃進(jìn)行。長的延伸時(shí)間有助于提高擴(kuò)增產(chǎn)量。

d. 為了防止擴(kuò)增過程中引入非目標(biāo)突變，強(qiáng)烈建議擴(kuò)增循環(huán)數(shù)≤35。如果擴(kuò)增效率良好的話，推薦擴(kuò)增循環(huán)數(shù)≤30。

反應(yīng)結(jié)束后取少量擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。如目標(biāo)質(zhì)粒正確擴(kuò)增，則可進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。

3. 擴(kuò)增產(chǎn)物DpnI消化，去除甲基化模板質(zhì)粒
因上述擴(kuò)增產(chǎn)物中包含原始模板質(zhì)粒，為防止其在轉(zhuǎn)化后形成假陽性轉(zhuǎn)化子，必須在進(jìn)行重組環(huán)化之前進(jìn)行DpnI消化。

推薦反應(yīng)體系如下：

將上述反應(yīng)體系置于37℃恒溫反應(yīng)1～2小時(shí)。如產(chǎn)物擴(kuò)增特異，產(chǎn)物條帶單一，DpnI消化產(chǎn)物無需純化，可直接用于后續(xù)重組反應(yīng)。如擴(kuò)增不特異，DpnI消化結(jié)束后應(yīng)膠回收純化目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。

4. 重組反應(yīng)

4.1 配制重組反應(yīng)體系

AB段和BA段擴(kuò)增產(chǎn)物末端分別包含*一致的一段序列，因此在Exnase催化下兩擴(kuò)增產(chǎn)物末端可以分別發(fā)生同源重組，完成環(huán)化過程。于冰水浴中，將下列組分依次加到無菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎將液體粘在管壁，請(qǐng)務(wù)必通過短暫離心使其沉入管底。體系配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，避免產(chǎn)生氣泡 (請(qǐng)勿劇烈震蕩或者渦旋混勻)。

不連續(xù)雙點(diǎn)突變重組反應(yīng)體系最適DNA使用量為：較長片段0.03 pmol，較短片段為0.06 pmol。這些摩爾數(shù)對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計(jì)算獲得：

較長片段DpnI消化產(chǎn)物使用量 = [0.02 × 片段堿基對(duì)數(shù)] ng (0.03 pmol)

較短片段DpnI消化產(chǎn)物使用量 = [0.04 × 片段堿基對(duì)數(shù)] ng (0.06 pmol)

例如，AB段長度為1 kb，BA段長度為5 kb。則DpnI消化產(chǎn)物最適使用量為：AB段0.04 ×1000 = 40 ng；BA段0.02 × 5000 = 100 ng。

注：DNA量太多或者太少都將降低環(huán)化效率。請(qǐng)務(wù)必通過瓊脂糖電泳預(yù)先確認(rèn)DNA濃度，盡量嚴(yán)格按照推薦量配制反應(yīng)體系。當(dāng)DpnI消化產(chǎn)物最適使用量計(jì)算值不足20 ng或者超過200 ng時(shí)，加入20ng或200 ng即可。DpnI消化產(chǎn)物不純化直接用于重組反應(yīng)時(shí)，使用量不應(yīng)超過反應(yīng)總體積的1/5，即4μl。

4.2 重組反應(yīng)

1）將上述體系置于50℃反應(yīng) 20 min。

2） 待反應(yīng)完成后，立即將反應(yīng)管置于冰水浴中冷卻。

3） 之后，反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化；也可儲(chǔ)存于-20℃，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化。

5. 反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板、克隆鑒定

1）  取10 μl冷卻反應(yīng)液，加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。

2）  42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2 min。

3）  加入900 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10min充分復(fù)蘇。

4）  37℃，200rpm-250rpm，搖菌45 min。

5）  取100 μl菌液均勻涂布在含有適當(dāng)抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

注: 我們推薦您使用轉(zhuǎn)化效率>108 cfu/μg的感受態(tài)細(xì)胞。如果感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率<108 cfu/μg (例如用CaCl2法新鮮制備的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率通常在106-107 cfu/μg之間)，請(qǐng)將培養(yǎng)菌液在5,000 rpm離心3 min收集菌體，用100 μl LB培養(yǎng)基重懸后全部涂板。

注意事項(xiàng)

1）引物設(shè)計(jì)時(shí)5’端反向互補(bǔ)區(qū)盡量選擇無重復(fù)序列，且GC含量比較均勻的區(qū)域。當(dāng)這一區(qū)域內(nèi)GC含量在40%～60%范圍之內(nèi)時(shí)，重組環(huán)化效率將達(dá)到最大。如這部分區(qū)域GC含量高于70%或者低于30%，重組環(huán)化效率會(huì)受到較大影響。

2）當(dāng)兩突變位點(diǎn)相距小于50bp時(shí)，應(yīng)將其視為一個(gè)突變位點(diǎn)，將兩突變引入同一條/對(duì)引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3）DpnI只能識(shí)別甲基化DNA，請(qǐng)務(wù)必使用從甲基化酶無缺陷的宿主菌中擴(kuò)增的質(zhì)粒作為PCR模板。

4）長期放置、反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致模板質(zhì)粒斷裂、開環(huán)或降解，應(yīng)使用新鮮制備的質(zhì)粒作為模板。

5）質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果需高度特異，雜帶較多會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

6）重組反應(yīng)體系中應(yīng)盡量避免金屬絡(luò)合劑(如EDTA)的帶入。因此，建議將DNA純化產(chǎn)物溶解在pH8.0的ddH2O中保存(常規(guī)膠回收試劑盒中的洗脫液可用pH8.0的ddH2O替代)，請(qǐng)勿使用TE進(jìn)行DNA保存。

7）冷卻后的重組反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)在1h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，且轉(zhuǎn)化前保持在冰水浴中。如需儲(chǔ)存，于-20℃凍存。盡量避免室溫較長時(shí)間放置或4℃長期儲(chǔ)存。

8）反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。另外，當(dāng)轉(zhuǎn)化的DNA濃度太高時(shí)，會(huì)抑制轉(zhuǎn)化反應(yīng)。將重組反應(yīng)產(chǎn)物稀釋5倍后取1/5進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

9）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
10）本產(chǎn)品僅作科研用途！

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