Cell Senescence β-Galactosidase Staining Kit

細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

細(xì)胞衰老（Cell senescence）是細(xì)胞控制其生長潛能的保障機(jī)制，一般含義是復(fù)制衰老（Replicative senescence，RS），指正常細(xì)胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂后，停止分裂，此時(shí)細(xì)胞雖然是存活的，但是細(xì)胞形態(tài)和生理代謝活性發(fā)生明顯變化的現(xiàn)象。體外衰老細(xì)胞研究常用的生物學(xué)特征包括：1）不可逆的生長停滯；2）與衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（senescence associated β-galactosidase, SA β-gal）的活化。作為溶酶體內(nèi)的水解酶，通常在pH 4.0的條件下表現(xiàn)活性，但是衰老細(xì)胞內(nèi)其在pH 6.0的條件下表現(xiàn)活性，且隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞群體中表現(xiàn)衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶的細(xì)胞數(shù)目逐漸增加。

本試劑盒正是基于SA β-gal活性變化的生物學(xué)特征而設(shè)計(jì)的，專門用于對(duì)衰老細(xì)胞或組織進(jìn)行染色檢測(cè)的一種技術(shù)。本試劑盒以X-Gal為底物，通過細(xì)胞內(nèi)SA β-gal在酸性條件下穩(wěn)定表達(dá)，催化底物生成深藍(lán)色產(chǎn)物，從而在光學(xué)顯微鏡下觀察顏色變化以分析細(xì)胞的衰老狀況。

本試劑盒適用于人和各種動(dòng)物體外培養(yǎng)細(xì)胞的衰老檢測(cè)。產(chǎn)品性能穩(wěn)定，參數(shù)經(jīng)優(yōu)化，著色敏感，特異性高。僅對(duì)衰老細(xì)胞進(jìn)行染色，不會(huì)染色衰老前的細(xì)胞（presenescent cells）、靜止期細(xì)胞（quiescent cells）、永生細(xì)胞（immortal cells）或腫瘤細(xì)胞。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，一年有效，其中X-Gal溶液需避光保存。

注意事項(xiàng)

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
2. 本試劑盒固定液B存在一定的腐蝕性和毒性，操作時(shí)請(qǐng)注意小心防護(hù)。
3. 染色液E剛剛?cè)芙夂髸?huì)觀察到有沉淀，屬正常現(xiàn)象，充分混勻或者漩渦震蕩可促使沉淀全部溶解，之后用于染色實(shí)驗(yàn)。
4. X-Gal溶液需要避光保存。染色工作液也需要避免光照。染色后的細(xì)胞樣品可以在 4ºC冰箱保存，但也需避免光照。
5. 細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性強(qiáng)，孵育3 h即顯示陽性；細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性弱，則需要孵育24 h。細(xì)胞染色zui長孵育時(shí)間為 24 h。細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色的部位即為衰老細(xì)胞特異性β-半乳糖苷酶活性部位。
6. 細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色反應(yīng)依賴于特定的pH值，不能用于細(xì)胞培養(yǎng)的CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行染色反應(yīng)。因?yàn)?/span>CO₂培養(yǎng)箱中較高濃度的CO₂會(huì)影響染色工作液的pH值，導(dǎo)致染色失敗。
7. 本試劑盒適合各種類型和規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35 mm 培養(yǎng)皿和各種孔數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)板，只需按照一定的比例調(diào)整工作液用量即可（參考表2）。

使用方法

1. 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作：

1. 染色工作液配制

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒內(nèi)各組分從冰箱內(nèi)取出，置于室溫回溫15~20min。其中X-Gal溶液C置入冰槽里等待溶化。根據(jù)以下染色工作液配方表（表1），實(shí)驗(yàn)體系類型，檢測(cè)樣本數(shù)，統(tǒng)一配制單次實(shí)驗(yàn)需要的染色工作液總量。混勻后，置入37ºC恒溫水槽里預(yù)熱，即為染色工作液。

表1 染色工作液配方表

注意：配制染色工作液時(shí)需使用聚丙烯（polypropylene）容器或玻璃容器，不宜使用聚苯乙烯（polystyrene）容器，對(duì)于二者的判定：聚丙烯容器可高壓滅菌，而聚苯乙烯容器則不可高壓滅菌，一旦高溫高壓處理就會(huì)嚴(yán)重變形。但是染色過程可以在聚苯乙烯容器內(nèi)進(jìn)行，如細(xì)胞培養(yǎng)常用的6孔板。

2）不同體系染色工作液用量

本試劑盒適合各種類型和規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35 mm 培養(yǎng)皿，和各種孔數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)板，可參考下表2 調(diào)整染色工作液用量：

注意：以上用量僅作為參考，對(duì)于染色工作液的實(shí)際用量以充分覆蓋住細(xì)胞和組織為準(zhǔn)。根據(jù)以上用量，本試劑盒對(duì)于6孔板，足夠做100個(gè)樣本的檢測(cè)；對(duì)于24孔板，足夠做400個(gè)樣本的檢測(cè)；對(duì)于96孔板，足夠做1000個(gè)樣本的檢測(cè)。對(duì)于組織切片足夠做100個(gè)樣本檢測(cè)。但是組織切片的厚度，大小對(duì)染色液用量的要求明顯不同，必須做合理用量調(diào)整。

1. 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板染色（貼壁細(xì)胞）：

1. 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用1ml清洗液A洗滌1次，加入1ml 固定液B，覆蓋整個(gè)生長表面。室溫固定15min。

注意：對(duì)于其他類型的培養(yǎng)板，固定液用量參照此比例進(jìn)行操作。

1. 吸除固定液B，用1ml清洗液A洗滌細(xì)胞3次，每次3min。
2. 吸除清洗液A，每孔加入1ml預(yù)熱的染色工作液，覆蓋整個(gè)生長表面。
3. 37℃孵育3 h～16 h，或直到細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色，可以用封口膜或保鮮膜封住6孔板防止液體蒸發(fā)。

注意：37℃孵育不能在CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行，因其內(nèi)高濃度的CO₂會(huì)影響染色工作液的pH值，導(dǎo)致染色失敗。

5） 普通光學(xué)顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)：表達(dá)SA β-gal的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，呈現(xiàn)藍(lán)色。如不能及時(shí)觀察計(jì)數(shù)，可以去除染色工作液，加入2ml 清洗液A或PBS緩沖液，4℃可以保存數(shù)天，或者加入封片劑封片后，4℃可保存較長時(shí)間。

1. 懸浮細(xì)胞染色：

1. 離心收集細(xì)胞至1.5ml離心管內(nèi)，用1ml清洗液A洗滌1次，加入1ml 固定液B，覆蓋整個(gè)生長表面。室溫固定15min。固定時(shí)可以在搖床上緩慢搖動(dòng)，以避免細(xì)胞結(jié)成團(tuán)塊。

1. 離心，吸除細(xì)胞固定液，用1ml清洗液A洗滌細(xì)胞3次，每次3min。
2. 離心，吸除清洗液A，每管加入0.5-1ml預(yù)熱的染色工作液。染色工作液的配制方法參見表1。
3. 37℃孵育3 h～16 h，或直到細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色（注：避免液體蒸發(fā)）。

注意：37℃孵育不能在CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行，因其內(nèi)高濃度的CO₂會(huì)影響染色工作液的pH值，導(dǎo)致染色失敗。

1. 取部分染色好的細(xì)胞，滴加到載玻片上或6孔板內(nèi)，普通光學(xué)顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)。如不能及時(shí)觀察計(jì)數(shù)，可以離心，去除染色工作液，加入1ml清洗液A或PBS緩沖液，4℃可以保存數(shù)天。也可取細(xì)胞用于涂片，加上封片劑封片后，4℃可保存較長時(shí)間。

1. 組織切片染色：

1. 對(duì)于石蠟切片先按照常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟或水化處理。對(duì)于冰凍切片直接按照以下步驟進(jìn)行；
2. 加入適當(dāng)體積的固定液B，以充分蓋住組織為宜，室溫固定不少于15min。
3. 用清洗液A浸泡洗滌組織3次，每次不少于5min；
4. 吸除清洗液A，加入適當(dāng)量的預(yù)熱的染色工作液。染色工作液的配制方法參見表1。
5. 37℃孵育24H，可以用封口膜或保鮮膜封住防止蒸發(fā)，把整個(gè)切片浸泡在染色工作液中。

注意：37℃孵育不能在CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行，因其內(nèi)高濃度的CO₂會(huì)影響染色工作液的pH值，導(dǎo)致染色失敗。

1. 普通光學(xué)顯微鏡下觀察和計(jì)數(shù)。如不能及時(shí)觀察計(jì)數(shù)，加上封片劑封片后4℃可保存較長時(shí)間。