鹽酸博萊霉素

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

鹽酸博來霉素是博來霉素/腐草霉素抗生素家族的一個(gè)成員，是從Streptomyces verticillus中分離的水溶性、銅離子螯合糖蛋白抗生素，銅離子存在使得溶液呈藍(lán)色。這種銅離子螯合形式是沒有活性的，當(dāng)抗生素進(jìn)入細(xì)胞后，Cu²⁺被還原成Cu⁺，并被細(xì)胞中的巰基化合物除去。此時(shí)，鹽酸博來霉素才被活化并與DNA結(jié)合，對DNA進(jìn)行切割，從而引起細(xì)胞死亡。而鹽酸博來霉素耐受基因（Sh ble）編碼的蛋白質(zhì)可以與鹽酸博來霉素結(jié)合，并抑制鹽酸博來霉素切割DNA。鹽酸博來霉素作用譜非常廣，其對細(xì)菌，真菌（包括酵母菌）、植物和哺乳動物細(xì)胞都有很強(qiáng)的抗菌活性，因此鹽酸博來霉素常用作一種非常有效的工具抗生素，用來篩選攜帶Sh ble抗性基因并能穩(wěn)定表達(dá)分子量為13.665 kDa的一種鹽酸博來霉素抗性蛋白的細(xì)胞株。

本產(chǎn)品為溶于高純度水的無菌溶液形式，濃度為100mg/ml，細(xì)胞培養(yǎng)級。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。產(chǎn)品-20°C避光保存。避免反復(fù)凍存，有效期1年。

應(yīng)用濃度

1. 大腸桿菌（E. coli）：25-50 µg/mL，用低鹽LB培養(yǎng)基篩選（NaCl濃度不能超過5 g/L)；

2. 酵母菌：50-300 µg/mL，用YPD或基本培養(yǎng)基（minimal medium）篩選；

3. 哺乳動物細(xì)胞：50-1000 µg/mL，根據(jù)細(xì)胞選擇合適的培養(yǎng)基。

操作步驟（哺乳動物細(xì)胞篩選）

【注】: 1. 鹽酸博來霉素用于篩選哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的濃度范圍為50-1000 µg/mL，平均工作濃度范圍為250-400 µg/mL。影響篩選濃度的主要因素包括離子強(qiáng)度，細(xì)胞類型，細(xì)胞密度以及生長速率。以下步驟僅作參考，請根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系做適當(dāng)調(diào)整。

2. 鹽酸博來霉素的殺滅機(jī)制不同于新生霉素（neomycin）和潮霉素（hygromycin），細(xì)胞不會聚集成團(tuán)或從培養(yǎng)板表面脫落。一旦接觸到鹽酸博來霉素，敏感細(xì)胞會出現(xiàn)如下的形態(tài)變化：1）細(xì)胞體積明顯增加（類似于巨細(xì)胞病毒感染容納性細(xì)胞引起的腫大效應(yīng)）；2）異常的細(xì)胞形狀包括細(xì)胞長臂（long appendages）出現(xiàn)；3）胞漿內(nèi)出現(xiàn)大型空泡（源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或支撐蛋白的破裂）；4）質(zhì)膜和核膜破裂，導(dǎo)致膜上出現(xiàn)許多孔。這些敏感細(xì)胞zui終會*破損，僅以細(xì)胞碎片的形式存在。

3. 鹽酸博來霉素抗性細(xì)胞繼續(xù)正常生長，長成不同于敏感細(xì)胞的克隆。形態(tài)上，其與未接觸鹽酸博來霉素的正常細(xì)胞沒有差異。

一．建立殺滅曲線

1. 重新鋪板或者將滿盤細(xì)胞重新分盤，使得細(xì)胞密度約25%，按照8個(gè)平板/組準(zhǔn)備，培養(yǎng)24 h。

2. 去除舊培養(yǎng)基。加入含不同濃度鹽酸博來霉素的篩選用培養(yǎng)基，鹽酸博來霉素濃度可設(shè)置為0，50，100，200，400，600，800和1000 μg/mL，每個(gè)濃度做3個(gè)平行；也可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系，設(shè)置不同的濃度梯度。

3. 每3-4天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察存活細(xì)胞的比例。選擇在合適的時(shí)間（1-2周內(nèi)）殺死大多數(shù)細(xì)胞的濃度為*工作濃度。

【注】：若是難以在顯微觀察下區(qū)分活細(xì)胞，也可用臺盼藍(lán)染色來計(jì)算存活細(xì)胞的數(shù)量，以確定鹽酸博來霉素的zui適濃度。

二．篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞

1. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用100 mm培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對照。

2. 轉(zhuǎn)染后，用預(yù)熱的1× PBS洗滌一次，加入新鮮培養(yǎng)基。

3. 轉(zhuǎn)染48-72 h后，用含有*濃度鹽酸博來霉素（由滅殺曲線確定）的新鮮培養(yǎng)基篩選細(xì)胞。為了更好的鑒定和篩選細(xì)胞集落，建議將細(xì)胞按比例稀釋成一系列濃度。

【注】：若待篩選細(xì)胞對鹽酸博來霉素的抗性明顯強(qiáng)于大部分細(xì)胞，或者細(xì)胞快速分裂導(dǎo)致低濃度情況鹽酸博來霉素的篩選效果不明顯，按照以下方法克服此類耐性：a）將細(xì)胞直接用含鹽酸博來霉素的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行分盤；b）37°C孵育2-3 h直至細(xì)胞貼壁；c）從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞并于4°C放置2 h，一定要確保培養(yǎng)基內(nèi)含有HEPES?！敬瞬降哪康脑谟诙虝r(shí)間內(nèi)終止細(xì)胞分裂活動，從而允許鹽酸博來霉素抗性得以發(fā)揮，殺死細(xì)胞?！?/span>d）細(xì)胞重新放回37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

4. 每3-4天加入選擇培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)細(xì)胞集落。

5. 挑選并轉(zhuǎn)移克隆到96或48孔板中。在進(jìn)行更大孔徑培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上擴(kuò)大培養(yǎng)之前，確保培養(yǎng)細(xì)胞密度近100%。

三、維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞

可采取以下方式維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，1）使用含相同劑量鹽酸博來霉素的篩選培養(yǎng)基來維持培養(yǎng)；2）降低鹽酸博來霉素劑量為原來的一半進(jìn)行維持培養(yǎng)；3）使用正好能預(yù)防敏感細(xì)胞生長但不足以致死的鹽酸博來霉素劑量來維持培養(yǎng)【參考?xì)缜€】。

注意事項(xiàng)

1. 本品具有一定的光敏感型，操作與培養(yǎng)過程盡量暗處進(jìn)行。產(chǎn)品保存盡量避光。

2. 本品有毒害，為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

HB170523