CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit

細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

是基于CFDA, SE對(duì)細(xì)胞進(jìn)行示蹤及增殖檢測(cè)的試劑盒，由CFDA,SE粉末、溶劑及相關(guān)細(xì)胞染色緩沖液組成，該試劑盒主要工作原理為：CFDA, SE具有細(xì)胞膜滲透性，本身不具有熒光發(fā)光性。當(dāng)通過被動(dòng)運(yùn)輸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞后，可被胞漿內(nèi)的酯酶催化生成羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE），后者可發(fā)強(qiáng)烈的綠色熒光，不能穿透細(xì)胞膜，能完好的保留在胞內(nèi)。CFSE還可自發(fā)性并不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合從而偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上，同時(shí)過量且未被偶聯(lián)的CFDA, SE通過被動(dòng)擴(kuò)散回到細(xì)胞外培養(yǎng)基內(nèi)，被后續(xù)清洗步驟所清除。經(jīng)CFDA, SE標(biāo)記的非分裂細(xì)胞的熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標(biāo)記的時(shí)間可達(dá)數(shù)月，因此非常適用于細(xì)胞群落分析。

CFDA, SE標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均一，優(yōu)于以前使用的其他細(xì)胞示蹤熒光探針如PKH26，并且分裂后的子代細(xì)胞的熒光分配也更均一。在細(xì)胞分裂增殖過程中，CFSE 標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，熒光強(qiáng)度變?yōu)橛H代細(xì)胞的一半，通過流式細(xì)胞儀（FL1通道）根據(jù)熒光強(qiáng)度的不同，可檢測(cè)出未分裂細(xì)胞，分裂一次（1/2的熒光強(qiáng)度），二次（1/4的熒光強(qiáng)度），三次（1/8的熒光強(qiáng)度），以及更多分裂次數(shù)的細(xì)胞。CFSA，SE可檢測(cè)分裂次數(shù)多達(dá)八次甚至更多。經(jīng)CFDA, SE標(biāo)記的細(xì)胞可用于體外和體內(nèi)增殖研究，且具有不會(huì)使鄰近細(xì)胞染色的功能。CFDA, SEzui常用于淋巴細(xì)胞的增殖檢測(cè)，也可用于成纖維細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，造血祖細(xì)胞等其他細(xì)胞的增殖檢測(cè)。

CFDA, SE標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，Ex=494 nm，Em=521 nm，除了流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖外，還可用熒光酶標(biāo)板定量活細(xì)胞數(shù)目，或者用熒光顯微鏡進(jìn)行均一染色的細(xì)胞示蹤觀察。

本品為CFDA，SE細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒，包含配制CFDA，SE儲(chǔ)存液所需的溶劑和細(xì)胞標(biāo)記用的染色緩沖液，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備工作。另，CFDA,SE標(biāo)記細(xì)胞一般15 min即可完成，對(duì)于不同細(xì)胞，需要自行摸索*標(biāo)記時(shí)間。按照每個(gè)樣本的標(biāo)記體積為2 mL計(jì)算。對(duì)應(yīng)貨號(hào)40714ES76和40714ES80的試劑盒可分別進(jìn)行500次和1000次檢測(cè)。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存

冰袋運(yùn)輸。-20℃干燥避光保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

1. CFDA,SE易被水解，在水溶液中會(huì)很快變質(zhì)。因此保存過程中粉末或者儲(chǔ)存液都需干燥保存；而且使用過程中避免接觸水。但在標(biāo)記細(xì)胞的過程中和水接觸是在許可范圍內(nèi)的。
   1. CFDA,SE溶劑在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，于20-25℃水浴溫育片刻至全部溶解后方可使用。
   2. 不同的細(xì)胞其細(xì)胞內(nèi)酯酶活性不同，因此染色效果具有差異性。
   3. 雖然本試劑盒已對(duì)CFDA,SE染色體系做了優(yōu)化處理，但建議使用者根據(jù)自身的細(xì)胞類型，培養(yǎng)條件以及應(yīng)用的不同來梯度摸索*的工作濃度，以zui低濃度得到適宜的標(biāo)記效率為準(zhǔn)。
   4. 熒光染料均存在淬滅問題，染色過程需盡量避光。
   5. 為了您的健康，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服和帶一次性手套。

操作方法

1. CFDA,SE儲(chǔ)存液（1000×）的配制

加入500 µL CFDA,SE溶劑到1管CFDA,SE熒光探針中進(jìn)行溶解，充分混勻即得到1000×的儲(chǔ)存液。

• 該儲(chǔ)存液在1個(gè)月內(nèi)使用完畢，zui長(zhǎng)不超過2個(gè)月。剩余儲(chǔ)存液請(qǐng)務(wù)必分裝后于≤-20℃避光干燥保存，避免反復(fù)凍融，-70℃避光保存可適當(dāng)延長(zhǎng)保存周期。
• 2×CFDA,SE工作液的配制

取適當(dāng)體積的細(xì)胞染色緩沖液（5×），用無菌的去離子水進(jìn)行5倍稀釋，配制成1×細(xì)胞染色緩沖液，并利用該緩沖液對(duì)上述CFDA,SE（1000×）儲(chǔ)存液進(jìn)行500×稀釋，如取2 μL CFSE儲(chǔ)存液加入到1 mL 1×細(xì)胞染色緩沖液中，混勻后即可得到2×CFDA,SE染色工作液。【注意】：雖然本試劑盒已對(duì)CFDA,SE染色體系做了優(yōu)化處理，但建議使用者根據(jù)自身的細(xì)胞類型，培養(yǎng)條件以及應(yīng)用的不同來梯度摸索*的工作濃度，以zui低工作濃度得到適宜的標(biāo)記效率為準(zhǔn)。

1. 操作步驟

1. 離心收集細(xì)胞，利用1 mL 1×細(xì)胞染色緩沖液懸浮細(xì)胞于15 mL離心管，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1-5×10⁶個(gè)/mL；
2. 把1 mL CFDA,SE工作液(2×)加入到上述15 mL離心管內(nèi)，輕輕混勻。
3. 37℃孵育10 min。【注意】：對(duì)于不同細(xì)胞，需要自行摸索*標(biāo)記時(shí)間。
4. 立即在15 mL離心管內(nèi)加入約10 mL*細(xì)胞培養(yǎng)液(含10% FBS)，室溫顛倒數(shù)下混勻，以終止標(biāo)記反應(yīng)。
5. 室溫離心去上清，再用5-10 mL*細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一次。
6. 再加入5-10 mL*細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃孵育10 min，以促進(jìn)CFSE【酯酶催化CFDA,SE得到的熒光產(chǎn)物】在細(xì)胞內(nèi)的駐留及未反應(yīng)的CFDA,SE進(jìn)入*細(xì)胞培養(yǎng)液。離心去上清，完成zui后一次洗滌。
7. 此時(shí)標(biāo)記好的細(xì)胞已可進(jìn)行后續(xù)的體外增殖檢測(cè)或者特定目的的細(xì)胞示蹤。按照正常方法培養(yǎng)細(xì)胞，然后在合適的時(shí)間點(diǎn)用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀【FL1通道】進(jìn)行結(jié)果分析，呈綠色熒光。標(biāo)記的細(xì)胞也可用于活體動(dòng)物的移植，并用熒光進(jìn)行示蹤。

【注意】：若需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，請(qǐng)用醛類固定劑如3.7%多聚甲醛于室溫固定15 min；之后若還需要進(jìn)行其他如抗體標(biāo)記，請(qǐng)用冰丙酮透化處理細(xì)胞10 min。

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