Phleomycin (20mg/ml in solution) 腐草霉素

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Phleomycin，中文名腐草霉素，由Streptomyces verticillus（輪枝鏈霉菌）的突變株產(chǎn)生的一種糖肽抗生素，屬于博來霉素(bleomycin)家族。抑菌機(jī)制在于腐草霉素可結(jié)合并插入DNA，從而破壞其雙螺旋結(jié)構(gòu)的完整性。腐草霉素對大多數(shù)細(xì)菌、真菌、酵母、植物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞都有活性，尤其適用于對Zeocin^TM敏感性低的細(xì)胞，如酵母菌和絲狀真菌。

腐草霉素是分子遺傳學(xué)研究中的選擇性抗生素之一，可用于篩選攜帶Sh ble基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Sh ble基因來源于Streptoalloteichus hindustanus，其可編碼一種14kDa的蛋白，該蛋白可與腐草霉素強(qiáng)烈結(jié)合從而抑制其切割DNA鏈的活性。腐草霉素是由多種結(jié)構(gòu)類似物構(gòu)成的復(fù)合物，這些復(fù)合物僅僅在末端胺基有所差異。另外，因?qū)儆阢~離子螯合的復(fù)合物，溶液呈藍(lán)色。

本品以20mg/ml的無菌溶液形式提供，可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)，在0.1-50μg/ml濃度范圍內(nèi)，腐草霉素可以抑制大多數(shù)好氧細(xì)胞的生長。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。

4°C或-20°C保存。4°C穩(wěn)定保存12個月，-20°C可穩(wěn)定保存18個月。避免反復(fù)凍融。

操作方法

【注1】細(xì)胞對腐草霉素的敏感性受pH值影響，如pH值越高，敏感性越高；另外，對于高滲透壓培養(yǎng)基如原生質(zhì)體再生用的培養(yǎng)基，腐草霉素的活性會明顯降低2-3倍。因此也可能通過使用低鹽培養(yǎng)基來降低腐草霉素使用量。

【注2】使用前需將低溫存放的腐草霉素置于室溫回溫，之后低速充分混勻。

1 大腸桿菌

攜帶bleomycin抗性基因如Sh ble，Tn5的質(zhì)粒，一旦轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌受體菌如HB101， DH5a， MC1061，賦予其腐草霉素抗性。

腐草霉素抗性的轉(zhuǎn)化子可以在添加5 μg/ml Phleomycin的低鹽LB瓊脂培養(yǎng)基（Yeast extract 5g/L, Tryptone 10g/L, NaCl 5g/L, Agar 15 g/L, pH 7.5）中進(jìn)行篩選。加有腐草霉素的平板可于4℃穩(wěn)定保存1個月。

2 酵母菌

釀酒酵母的腐草霉素抗性轉(zhuǎn)化子可在添加10 μg/ml Phleomycin的YEPD培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。

操作步驟：按常規(guī)方法進(jìn)行酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，一旦DNA進(jìn)入細(xì)胞后，用YEPD培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞并置于搖床上培養(yǎng)6h或過一個晚上，使其抗性性狀得以表達(dá)。之后將細(xì)胞冰浴1h并涂布培養(yǎng)在添加10 μg/ml Phleomycin的YEPD（pH 7.0）固體培養(yǎng)基上。

3 真菌

根據(jù)轉(zhuǎn)化子對Phleomycin 的敏感性不同，在添加有10-50 μg/ml腐草霉素的再生培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行篩選。先將細(xì)胞在4℃孵育過一個晚上然后置于生長溫度培養(yǎng)，可提高其對抗生素的敏感性。

4 植物細(xì)胞

根據(jù)植物類型不同，選擇5-25 μg/ml Phleomycin進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選。

5 哺乳動物細(xì)胞

5-50 μg/ml Phleomycin，推薦先通過建立滅殺曲線來確定*濃度。與G418做比較，可能需要更長的時間來殺死細(xì)胞或者使細(xì)胞從平板上脫落，尤其當(dāng)細(xì)胞處于高密度的情況。

依細(xì)胞系不同，通常需要5~21天來挑選具腐草霉素抗性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

注意事項

1）腐草霉素對濃酸較為敏感，但可短時間暴露于稀酸中。使用前將本品回溫至室溫，并輕輕混勻。

2）腐草霉素有毒，避免直接接觸皮膚，不可吞服。酸性或堿性pH，或次磷酸鈉中會即刻失效。

3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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