Alamar Blue 阿爾瑪藍

產(chǎn)品信息

檢測原理

阿爾瑪藍（Alamar Blue）是一種氧化還原指示劑，能根據(jù)代謝活性產(chǎn)生吸亮度變化和熒光信號。這是一種安全無毒的染料，可用于細胞活性和細胞增殖的定量分析以及細胞因子生物測定和體外細胞毒性研究，能有效測定動物、真菌和細菌細胞的天然代謝活性。Alamar Blue在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍色無熒光性，而在還原狀態(tài)下，轉(zhuǎn)變?yōu)槌史奂t或紅色熒光的還原產(chǎn)物，反映所研究的細胞或微生物對氧分子的消耗，因而常被用作氧化還原指示劑，以顯示被觀察細胞和細菌的代謝活動。這種測定是基于具有代謝活性的細胞將試劑轉(zhuǎn)換成熒光和比色指示劑的能力。在細胞增殖過程中，細胞內(nèi)NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，處于還原環(huán)境。攝入細胞內(nèi)的染料被這些代謝中間體及細胞色素類還原后釋放到細胞外并溶于培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基從無熒光的靛青藍變成有熒光的粉紅色。受損和無活性細胞具有較低的天然代謝活性，因此對應的信號較低?？梢杂闷胀ǚ止夤舛扔嫽驘晒夤舛扔嫏z測，其激發(fā)光波長在530-560 nm之間，發(fā)射光波長為590 nm。吸光度和熒光強度與活性細胞數(shù)成正比。

本品可廣泛地用于細胞增殖代謝，藥物的細胞毒作用的體外測定以及病原微生物的的快速檢測與鑒定。 與臺盼蘭、TTC、MTT、MTS等分析法相比，Alamar Blue具有更多的優(yōu)勢。Alamar Blue采用單一試劑，可以連續(xù)、快速地檢測細胞的增生狀態(tài)。由于Alamar Blue對細胞無毒、無害，不影響細胞的抗體合成與分泌等活性，因此可以對同一批細胞的增生狀態(tài)進行連續(xù)觀察和進一步的實驗觀察，因此有操作簡便和幾乎不干擾細胞正常代謝的特點。 

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸。產(chǎn)品4oC避光保存，至少一年有效。

注意事項

1） 需客戶自行準備100%還原型Alamar Blue試劑。為得到還原型Alamar Blue，需配制Alamar Blue與細胞培養(yǎng)基的混合溶液，Alamar Blue與細胞培養(yǎng)基的比值為1:10，高壓滅菌15min。（不能對濃縮的Alamar Blue高壓滅菌，也不能用PBS配制溶液，因為100%還原型Alamar Blue在PBS中不穩(wěn)定。）

2） 為得到的結(jié)果，建議實驗前先摸索孵育時間和接種細胞數(shù)量。

3） 合適密度的細胞可以增加檢測靈敏度。對于96 孔板，我們建議每孔接種100 微升細胞，細胞濃度范圍為：貼壁細胞在100-10,000/孔，懸浮細胞在2,000-50,000/孔，并以培養(yǎng)基為空白對照。對于384 孔板，細胞濃度和接種量均減半。

4） 整個過程均應為無菌操作，因為微生物污染物同樣可以還原檢測試劑而影響實驗結(jié)果。

5） 注意接種細胞濃度和加入檢測試劑后孵育時間。細胞濃度過高或孵育時間過長，會導致繼發(fā)性還原反應，產(chǎn)生無色和熒光消失。

6） 孵育時，須避光。

7） 本產(chǎn)品可以使用熒光或分光光度計檢測，但熒光的靈敏度高，實驗誤差小，推薦使用熒光檢測。

操作說明

一、制作標準曲線（測定*孵育時間和細胞數(shù)量）

1. 每孔加入100微升細胞懸液（對數(shù)生長期細胞），對細胞計數(shù)。按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每個濃度建議3-6個復孔。注：設置陰性對照：細胞培養(yǎng)基中不加入細胞；陽性對照：100微升100%還原型Alamar Blue（不含細胞）。

2. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽性對照孔中加入10微升無菌的超純水。

3. 放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（37℃,5% CO₂）一定時間。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍開始變成粉紅色就可以進入下一步。

4. 推薦用熒光分光光度計檢測，激發(fā)光波長在530-560 nm之間，發(fā)射光波長為590 nm。

5. 普通分光光度計在570nm測定吸光度，參考波長600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

6. 繪制標準曲線。以細胞數(shù)量或孵育時間為橫坐標（X軸），Alamar Blue還原率為縱坐標（Y軸）。根據(jù)此標準曲線可以測定出適合的細胞數(shù)量或孵育時間（使用此標準曲線的前提是實驗的條件要*）。

二、細胞毒性和細胞增殖檢測

1. 每孔加入100微升細胞懸液（對數(shù)生長期細胞），對細胞計數(shù)。建議細胞數(shù)量為10⁴/ml，具體每孔需要的細胞數(shù)量，需根據(jù)細胞類型決定。

2. 細胞中加入待檢測藥物，為檢測藥物對細胞增殖的作用，請設置合適的對照組，包括刺激細胞和非刺激細胞。

3. 混勻，放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃,5% CO₂）一段時間。

4. 每孔加入10微升Alamar Blue。陽性對照孔中加入10微升無菌的超純水。

5. 放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（37℃,5% CO₂）4-8h，*孵育時間取決于細胞類型。培養(yǎng)基的顏色由靛青藍開始變成粉紅色就可以進入下一步。

6. 推薦用熒光分光光度計檢測，激發(fā)光波長在530-560 nm之間，發(fā)射光波長為590 nm。

7. 普通分光光度計在570nm測定吸光度，參考波長600nm。也可用570/630 nm和540/600 nm替代。

活力計算                                         

1. 普通分光光度計檢測

Alamar Blue還原率（％）=[（E600×A570）-（E570×A600）]/[(E570′×C600)-E600′×C570] ×100

E570=氧化型Alamar Blue在570nm波長的消光系數(shù)=80586；

E600=氧化型Alamar Blue在600nm波長的消光系數(shù)=117216；

A570=檢測孔在570nm波長的吸亮度；

A600=檢測孔在600nm波長的吸亮度；

E570′=還原型Alamar Blue在570nm波長的消光系數(shù)=155677；

E600′=還原型Alamar Blue在600nm波長的消光系數(shù)=14652；

C570=陰性對照孔在570nm波長的吸亮度（培養(yǎng)基，Alamar Blue，無細胞）；

C600=陰性對照孔在600nm波長的吸亮度（培養(yǎng)基，Alamar Blue，無細胞）；

如果使用570/630 nm和540/600 nm作為替代，則：

E540=氧化型Alamar Blue在540nm波長的消光系數(shù)=47619；

E630=氧化型Alamar Blue在630nm波長的消光系數(shù)=34798；

E540′=還原型Alamar Blue在540nm波長的消光系數(shù)=104395；

E630′=還原型Alamar Blue在630nm波長的消光系數(shù)=5494；

2. 熒光分光光度計檢測

Alamar Blue還原率（％）= （實驗組F590-陰性對照組F590）/（100%還原型陽性對照F590-陰性對照組F590）×100

F590=590nm波長熒光值