SulfoLink Coupling Resin  巰基蛋白瓊脂糖偶聯(lián)樹(shù)脂

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

SulfoLink Coupling Resin是一類預(yù)活化樹(shù)脂，其純化原理在于可以通過(guò)與巰基或者氨基的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)抗原的固定化，進(jìn)而利用抗原抗體的特異性反應(yīng)對(duì)免疫血清中的抗體進(jìn)行高效純化，是多克隆抗體生產(chǎn)中*的純化介質(zhì)。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。4℃保存。

注意事項(xiàng)

1）SulfoLink Coupling Resin使用前一定要充分顛倒若干次，使瓊脂糖珠混合均勻。

2）所有操作過(guò)程中，樣本需要在4℃或冰上操作。

3）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

針對(duì)巰基和氨基的偶聯(lián)條件有所差異，請(qǐng)分別進(jìn)行選擇。

1含巰基抗原的偶聯(lián)流程

1.1 緩沖液準(zhǔn)備

所用水和 Buffer 在使用之前建議用0.22 μm或0.45μm濾膜過(guò)濾。

偶聯(lián)液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5

封閉液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, 50 mM L-半胱氨酸，pH 8.5

保護(hù)液：20 mM PBS，20%乙醇，pH 8.0

結(jié)合/洗雜液：20 mM PBS，pH 8.0

洗脫液：100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl, pH 8.5

1.2  抗原準(zhǔn)備

使用偶聯(lián)液溶解抗原，制備成終濃度為 1-3 mg/ml 的抗原溶液。建議該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響偶聯(lián)效果。

【注】：① 抗原樣品使用前務(wù)必確保其巰基處于還原狀態(tài)（可以使用 DTNB(Ellman's Reagent), Yeasen Cat#60306）檢測(cè)自由巰基的含量）。如果巰基已經(jīng)氧化，必須對(duì)抗原進(jìn)行還原，一般推薦使用還原劑 TCEP（Tris(2-carboxyethyl)phosphine, Yeasen Cat# 20330），TCEP 溶液很穩(wěn)定，可以選擇性的、高效的打開(kāi)抗原中的二硫鍵，并且不影響抗原與樹(shù)脂的偶聯(lián)反應(yīng)，每毫克抗原中 TCEP 的添加量不超過(guò)12mg，具體使用量需要自行優(yōu)化。

② 如果使用 DTT 等含有巰基的還原劑，處理完樣品必須要將還原劑去除，否則會(huì)影響抗原與樹(shù)脂的偶聯(lián)效率。

1.3抗原偶聯(lián)

1）取適量SulfoLink Coupling Resin，加入到合適的重力柱中，靠重力流干保護(hù)液，用3倍柱體積的偶聯(lián)液平衡樹(shù)脂，待偶聯(lián)液流干，再加入3倍柱體積的偶聯(lián)液，重復(fù)操作 2遍。共使用9倍柱體積的偶聯(lián)液。

2）關(guān)閉柱子的下端出口，加入等體積的含巰基的抗原，混勻，取出至合適的離心管中，置于28℃震蕩孵育30min。

【注】：確保樹(shù)脂充分懸浮起來(lái)，否則將大大影響偶聯(lián)效率。

3）將上述反應(yīng)體系取出，轉(zhuǎn)移至重力柱中，流干其中溶液，并收集流出液，再用3倍柱體積的偶聯(lián)液清洗樹(shù)脂，合并兩次流出液。

【注】：如有需要，可以使用 Ellman’s Reagent 檢測(cè)其中巰基含量，得出抗原殘留量，從而計(jì)算偶聯(lián)效率。

4）關(guān)閉柱子的下端出口，加入等體積的封閉液，混勻，轉(zhuǎn)移至合適的離心管中，于28℃震蕩孵育30min。

5）將上述反應(yīng)體系取出，轉(zhuǎn)移至重力柱中，流干其中的封閉液。

【注】：如果立即使用，可以參考【抗體純化】操作。如果以后使用，可以用3倍柱體積的結(jié)合液清洗樹(shù)脂，然后保存在等體積的保護(hù)液中，于 4℃冰箱保存。

1.4  抗體純化

1）將偶聯(lián)了抗原的樹(shù)脂裝入合適的層析柱，用5倍柱體積的結(jié)合液進(jìn)行平衡，使填料處于與抗體更易結(jié)合環(huán)境中，一方面保護(hù)目標(biāo)抗體，另一方面提高抗體結(jié)合效率。

2）將含有抗體的樣品加到平衡好樹(shù)脂中，為了保證抗體與樹(shù)脂充分接觸，提高目標(biāo)抗體的回收率，可以控制上樣流速在0.5-1 ml/min，并收集流出液。

3）用10-15倍柱體積的洗雜液進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，提高目的抗體的純度，收集洗雜液。

4）使用5-10倍柱體積的洗脫液，收集洗脫組分，即目的抗體。

【注】：為了保持抗體活性，需要立即將洗脫組分透析至pH 7.0-8.0的緩沖液中，或者先加入1/10倍洗脫組分體積的中和液，將洗脫組分進(jìn)行中和，再透析。

5）依次使用3倍柱體積的結(jié)合液和5倍柱體積的去離子水平衡樹(shù)脂，zui后再用5倍柱體積的保護(hù)液平衡，然后保存在等體積的保護(hù)液中，置于4℃保存，防止填料被細(xì)菌污染。

2  含氨基抗原偶聯(lián)流程

2.1 緩沖液準(zhǔn)備

所用水和 Buffer 在使用之前建議用 0.22μm或0.45μm濾膜過(guò)濾。

偶聯(lián)液：0.1 M NaHCO₃，0.5 M NaCl，pH 8.5

封閉液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, 50 mM L-半胱氨酸，pH 8.5

保護(hù)液：20 mM PBS，20%乙醇，pH 8.0

結(jié)合/洗雜液：20 mM PBS，pH 8.0

洗脫液：100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl, pH 8.5

2.2抗原偶聯(lián)

1）使用偶聯(lián)液溶解抗原，制備成終濃度為5-10 mg/ml的抗原溶液。

2）取適量SulfoLink Coupling Resin，加入到合適的重力柱中，靠重力流干保護(hù)液，用3倍柱體積的偶聯(lián)液平衡樹(shù)脂，待偶聯(lián)液流干，再加入3倍柱體積的偶聯(lián)液，重復(fù)操作2遍。共使用9倍柱體積的偶聯(lián)液。

3）關(guān)閉柱子的下端出口，加入等體積的含氨基的抗原，混勻，取出轉(zhuǎn)移至合適的離心管中，置于 28℃震蕩孵育3-5h，或者4℃震蕩孵育一個(gè)晚上（12-15h）。

【注】：確保樹(shù)脂充分懸浮起來(lái)，否則將大大影響偶聯(lián)效率。

4）將上述反應(yīng)體系取出，轉(zhuǎn)移至重力柱中，收集流出液，再用3倍柱體積的偶聯(lián)液清洗樹(shù)脂，合并兩次流出，待測(cè)試。

5）關(guān)閉柱子的下端出口，加入等體積的封閉液，混勻，取出轉(zhuǎn)移至合適的離心管中，置于28℃震蕩孵育30min。

6）將上述反應(yīng)體系取出，轉(zhuǎn)移至重力柱中，流干其中的封閉液。

【注】：如果暫不使用，可以用3倍柱體積的結(jié)合液清洗樹(shù)脂，然后保存在等體積的保護(hù)液中，于4℃保存。

2.3 抗體純化

1）將偶聯(lián)了抗原的樹(shù)脂裝入合適的層析柱，用5倍柱體積的結(jié)合液進(jìn)行平衡，使填料處于與抗體更易結(jié)合環(huán)境中，一方面保護(hù)目標(biāo)抗體，另一方面提高抗體結(jié)合效率。

2） 將含有抗體的樣品加到平衡好樹(shù)脂中，為了保證抗體與樹(shù)脂充分接觸，提高目標(biāo)抗體的回收率，可以控制上樣流速在 0.5-1 ml/min，并收集流出液。

3）用10-15 倍柱體積的洗雜液進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，提高目的抗體的純度，收集洗雜液。

4）使用5-10倍柱體積的洗脫液，收集洗脫組分，即目的抗體。

【注】：為了保持抗體活性，需要立即將洗脫組分透析至pH7.0-8.0的緩沖液中，或者先加入1/10倍洗脫組分體積的中和液，將洗脫組分進(jìn)行中和，再透析。

5）依次使用3倍柱體積的結(jié)合液和5倍柱體積的去離子水平衡樹(shù)脂，zui后再用5倍柱體積的保護(hù)液平衡，然后保存在等體積的保護(hù)液中，置于4℃保存，防止填料被細(xì)菌污染。

3  SDS-PAGE 檢測(cè)

將純化抗體樣品得到的流出組分、洗雜組分和洗脫組分以及原始含抗體樣品使用SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

4 問(wèn)題與解決方案

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