產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Caspase 3，即Cysteine-requiring Aspartate Protease 3，也稱CPP32、Yama或apopain，屬于Caspase家族的CED-3亞家族(CED-3 subfamily)，系一種在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶，也是哺乳動物細胞中研究zui多的一個Caspase。 Caspase 3可以剪切procaspase 3、6、7和9，且可以直接特異性剪切多種Caspase底物，包括PARP(poly(ADP-ribose)polymerase)、ICAD(Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)、gelsolin和fodrin等。這些由Caspase 3介導(dǎo)的蛋白剪切是細胞凋亡分子機制的重要組成部分。另外，caspase 3在細胞核凋亡和細胞起泡(Cell blebbing)過程中也起到了關(guān)鍵作用，包括染色質(zhì)固縮(chromatin condensention)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。

Caspase 3 Assay Kit, Colorimetric是一款簡單快速檢測細胞或組織內(nèi)Casepase 3活性的試劑盒，其檢測原理是基于Casepase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)產(chǎn)生黃色的pNA(p-nitroaniline)，pNA在405nm附近有強吸收，從而可以通過測定吸光度來檢測Caspase 3的活性（黃色產(chǎn)物與Caspase 3酶的活性成正比）。 另外，本試劑盒中還提供了Caspase 3催化產(chǎn)生的黃色產(chǎn)物pNA，以此作為定量caspase 3酶活性的標(biāo)準(zhǔn)品。

本試劑盒相關(guān)貨號40313ES20和40313ES60用酶標(biāo)儀檢測或容量不超過100μl的分光光度檢測杯檢測時，除標(biāo)準(zhǔn)曲線外分別可以檢測20、100個樣品。

產(chǎn)品組分

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃保存，Ac-DEVD- pNA和pNA需避光保存。

注意事項

1）建議Ac-DEVD- pNA分裝保存，盡量避免反復(fù)凍融；

2）pNA(中文名為4-硝基苯胺)有毒，請注意小心防護。pNA(10mM)在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

3）有報道少數(shù)類型細胞凋亡檢測不到Caspase 3 的激活；

4）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1 準(zhǔn)備工作

1）裂解液溶解后混勻并置于冰浴上備用。

2）檢測緩沖液溶解后混勻并置于冰浴上備用。

2 測定pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

1）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制：按照每0.9ml檢測緩沖液加入0.1ml裂解液的比例配制適量的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

2）把試劑盒提供的pNA (10mM)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋為0、10、20、50、100和200μM，作為標(biāo)準(zhǔn)品。

3）每個濃度取100μl用酶標(biāo)儀進行檢測，或取適當(dāng)量用容量不超過100μl的分光光度檢測杯進行檢測，測定其A₄₀₅。

4）每一個標(biāo)準(zhǔn)品的A₄₀₅減去不含pNA的空白對照的A₄₀₅計算出實際的因pNA而導(dǎo)致的吸光度，并制作出 pNA濃度相當(dāng)于A₄₀₅的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 樣品收集

1）樣品處理

按照實驗設(shè)計，加入適量藥物誘導(dǎo)細胞，并同時設(shè)置未經(jīng)藥物誘導(dǎo)的對照組。并按照以下方法進行處理。

① 對于懸浮細胞：把沒有誘導(dǎo)凋亡的對照樣品和誘導(dǎo)凋亡的樣品，600g 4℃離心5min收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌一次。吸盡上清后，按照每2×10⁶細胞加入100µl裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15min。

② 對于貼壁細胞：吸取細胞培養(yǎng)液，備用。用胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養(yǎng)液中。600g 4℃離心5min收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌一次。吸盡上清后，按照每2×10⁶細胞加入100µl裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15min。

③ 對于組織樣品：按照每3-10mg組織加入100µl裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿。然后把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，冰浴再裂解5min。

2）4℃ 16,000-20,000g離心10-15min。

3）把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。

4）立即測定caspase 3的酶活性或-70℃保存樣品。同時可以取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達到1-3mg/ml，相當(dāng)于每10µl待測樣品中含有10-30μg蛋白。如果細胞較小，可以適當(dāng)增加細胞的用量。

【注】：用Bradford法檢測待測樣品中蛋白濃度(由于裂解液中含有較高濃度的DTT，不適合采用BCA法測定蛋白濃度)。

4  Caspase 3酶活性的檢測

1）取出適量的Ac-DEVD-pNA(2mM)，置于冰浴上備用。

2）如表1設(shè)置反應(yīng)體系：

表1 反應(yīng)體系配制表

【注】：在設(shè)置反應(yīng)體系時先加檢測緩沖液，再加待測樣品，適當(dāng)混勻，注意避免產(chǎn)生氣泡。隨后再加入10μl Ac-DEVD-pNA (2mM)。

3）加入Ac-DEVD-pNA(2mM)后混勻，注意避免在混勻時產(chǎn)生氣泡。37℃孵育1-2h。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時即可測定A₄₀₅。如果顏色變化不明顯，可以適當(dāng)延長孵育時間，甚至可以孵育一個晚上。

4）樣品的A₄₀₅扣除空白對照的A₄₀₅，即為樣品中Caspase 3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度。通過同步驟2中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的對比就可以計算出樣品中催化產(chǎn)生了多少量的pNA。

5）Caspase 3酶活力單位的定義：即一個酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r，在37℃1h內(nèi)可以剪切1nM Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生1nM pNA的Caspase 3的酶量。這樣就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的Caspase 3。

【注】：在本試劑盒的檢測體系中，底物的起始濃度為0.2mM，此時底物是飽和的，對于許多樣品而言在37℃孵育2h以

內(nèi)底物都是飽和的；對于樣品中Caspase 3酶活力特別高的情況，須用裂解液適當(dāng)稀釋樣品后再進行測定。

常見問題

1. 測定出的A₄₀₅過低：

1）樣品中蛋白含量太低，裂解樣品時需設(shè)法使樣品中的蛋白濃度接近1-3mg/ml。

2）樣品中激活的Caspase水平很低。首先確認(rèn)凋亡現(xiàn)象是否明顯，如果凋亡比較明顯并且確認(rèn)該Caspase是可以被激活的，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)細胞凋亡的時間，希望能找到一個Caspase激活比較強的時間點，這樣就可以檢測出該Caspase的激活。可以作一時間曲線，例如誘導(dǎo)凋亡0、2、4、8、16和24小時，或0、1、2、4、8和16小時，或0、1、2、4、6和8小時等。具體的誘導(dǎo)凋亡時間需根據(jù)具體情況而定。

2. 測定出的A₄₀₅過高或者樣品量不足

可以參考下表的反應(yīng)體系適當(dāng)減少樣品的用量；

表2 反應(yīng)體系配制表

【注】：其中x不超過50，其余檢測方法同上面的使用說明所述。