產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61 kDa的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，能夠催化螢光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在氧化的過程中會發(fā)出波長為560 nm左右的生物螢光。海腎螢光素酶（Renilla luciferase）是一種分子量約為36 kDa的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素（coelenterazine）氧化成coelenteramide，在氧化的過程中會發(fā)出波長為480nm左右的生物熒光。兩種生物熒光都可通過化學發(fā)光儀進行測定。檢測原理如圖所示：

圖1：螢火蟲和海腎螢光素酶檢測原理圖

通常將目的基因的5′UTR或啟動子克隆至Firefly Luciferase的上游，或3′UTR克隆至Firefly Luciferase的下游，通過檢測螢火蟲螢光素酶的量來檢測啟動子或調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Renilla Luciferase作為內(nèi)參，來消除細胞數(shù)量、轉(zhuǎn)染效率等的差異。Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit首先以螢光素為底物來檢測螢火蟲螢光素酶報告基因的活性，之后在淬滅該螢光反應的同時，以腔腸素為底物檢測海腎螢光素酶報告基因的活性。該試劑盒具有靈敏度高的特點。

產(chǎn)品組分

運輸和保存方式

干冰運輸。 -20℃保存，有效期1年。

螢火蟲螢光素酶反應工作液和海腎螢光素酶反應工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，且不能反復凍融，建議分裝-20℃或-80℃保存。

實驗步驟

I.前處理

1.細胞

1）構(gòu)建相應的載體。

2）轉(zhuǎn)染步驟請參照相關(guān)的說明書。

3）將細胞裂解液充分混勻，按如下方式加入細胞裂解液，充分裂解細胞。

a: 對于貼壁細胞，吸盡細胞培養(yǎng)液，按照下表比例加入細胞裂解液，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板使裂解液*覆蓋細胞；

b: 對于懸浮細胞，離心棄去上清，按照下表比例加入裂解液。

冰上孵育5 min，充分裂解細胞。

【注】：裂解產(chǎn)物可室溫保存6 h；4℃保存16 h；-80℃可長期存放。（裂解產(chǎn)物不能多次反復凍融），本試劑盒裂解液數(shù)量按照24孔板添加量進行配置，如需要更多可單獨購買（CAT#11406）。

5）（選作）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。

2.葉片組織（以煙草葉片為例，僅供參考）

1）構(gòu)建相應的載體。

2）挑取轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種到2 mL LB液體培養(yǎng)基（添加相應抗生素）中，28℃ 220 rpm培養(yǎng)過夜。

3）農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600為1.0，1700× g離心5 min收集菌體后，用1/2MS液體培養(yǎng)基清洗菌體2次；用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌的OD600調(diào)至1.0。

4）將待檢測的農(nóng)桿菌菌液進行混合，使每種菌液的OD600為0.5。

5）選取生長期為1個月左右*伸展的煙草葉片，將混合好的菌液用1 mL注射器(去掉針頭)從煙草葉背面進行注射。為保證實驗結(jié)果的一致性，需要將對照載體和待檢測目標載體的菌液注射在同一葉片的不同部位上, 以保證相同的生長背景。

6）正常溫室生長條件下，24-48 h即可取樣觀察。

7）取3-4片直徑為6-8 mm的葉盤，放入2 mL的EP管（提前放入3-4個小鋼珠）中，液氮中冷凍，使用破碎儀進行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎*后在EP管中加入100 μL裂解液。

8）冰上孵育5 min左右，充分裂解葉片。

9）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。

3.原生質(zhì)體（僅供參考）

構(gòu)建相應的載體。

制備原生質(zhì)體（參考文獻：Yoo SD, Cho YH, Sheen J (2007). Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc 2, 1565–1572）。

在2 mL EP管中加入相應的載體（加入量需要摸索），加入100 μL原生質(zhì)體懸浮液。輕搖混勻后，加入110 μL PEG-CaCl2溶液，輕彈混勻。在室溫放置10-15 min。

4）加入440 μL W5溶液，上下顛倒以停止轉(zhuǎn)化。

5）200 × g 室溫離心5 min，棄去上清，加入800 μL WI溶液重懸原生質(zhì)體。

室溫避光培養(yǎng)16-24 h。

7）將原生質(zhì)體加入2 mL離心管中，離心收集原生質(zhì)體，加入100 μL左右的裂解液。

8）冰上孵育5 min左右，充分裂解原生質(zhì)體。

9）（選做）10000-16000 rpm離心1 min，取上清。

II.熒光檢測

1）取20 μL裂解液，加至培養(yǎng)板中。按照實驗需要，可設置3孔-5孔重復。

2）配制螢火蟲螢光素酶反應工作液和海腎螢光素酶反應液，即螢火蟲螢光素酶底物（50 ×）和海腎螢光素酶底物（50 ×）

分別用對應的緩沖液稀釋至1 ×工作液。并孵育至室溫。

3）加入100 μL螢火蟲螢光素酶反應液，震板混勻，檢測螢火蟲螢光素酶的活力，檢測盡量在30 min內(nèi)完成。

4）加入100 μL海腎螢光素酶反應液，震板混勻，檢測海腎螢光素酶的活力，檢測盡量在30 min內(nèi)完成。

5）分析數(shù)據(jù)。

①實驗設計：根據(jù)不同實驗目的，在每個培養(yǎng)板中都應設置對照組、實驗組和空白對照組。為了保證實驗準確性，理論上每個實驗組（包括對照組）都應當減去空白對照組的螢火蟲和海腎螢光素酶的發(fā)光測量值。

a.空白對照組：

背景F：未轉(zhuǎn)染細胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑。

背景R：未轉(zhuǎn)染細胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑+海腎螢光素酶檢測試劑。

注：空白對照組的樣品量必須與實驗樣品量相同，包含與實驗樣品相同的培養(yǎng)基/血清組合，并加上*相同的檢測試劑。

b.實驗組：轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)實驗化合物處理(即實驗組F和實驗組R)。

c.對照組：轉(zhuǎn)染細胞不經(jīng)處理，用以標準化結(jié)果(即對照組F和對照組R)。

②計算結(jié)果：

實驗組比值=(實驗組F-背景F）/(實驗組R-背景R)。

對照組比值=(對照組F-背景F）/(對照組R-背景R)。

表達倍數(shù)=實驗組比值/對照組比值。

圖2：細胞樣品螢火蟲和海腎螢光素酶檢測流程圖

注意事項

1）檢測過程中需自備耗材和設備包括如下：PBS、100 μL移液器或者排槍、不透光白色酶標板、Luminometer發(fā)光計、多功能酶標儀或者其他能夠檢測生物發(fā)光的儀器；

2）反應溫度：酶促反應對溫度較為敏感，加樣檢測前務必將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）再使用；

3）檢測儀器：能檢測化學發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設置和靈敏度不同，測得的光信號值也會不同；

4）檢測設置：Luminescence，350-700 nm，建議檢測時間設為2-10 sec；

5）檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光白色酶標板。黑色酶標板也可用，但因黑色會吸收光信號，可能會降低信號；

6）單管熒光測定儀測定，每個樣品與測定試劑混合后到測定前的時間應保持一致；

7）E組分海腎螢光素酶底物易揮發(fā)，注意密封保存；

8）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套。

9）本產(chǎn)品僅作科研用途！

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HB220325