Hieff NGS^® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina^®

(for 50 ng)

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff NGS^® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina^® (for 50 ng)是針對(duì)lllumina^®高通量測(cè)序平臺(tái)專業(yè)開發(fā)設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)座酶法建庫(kù)試劑盒，適用于50 ng的基因組DNA、cDNA、擴(kuò)增子（>500 bp）等樣本的建庫(kù)。與常規(guī)分步法建庫(kù)相比，Hieff NGS^® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina^®采用新型轉(zhuǎn)座酶和優(yōu)化的緩沖體系，僅需10 min即可完成DNA  pian段化、末端修復(fù)和接頭連接過程，顯著縮短建庫(kù)時(shí)間至1.5小時(shí)以內(nèi)，并獲得優(yōu)異的測(cè)序質(zhì)量。此外，本試劑盒已經(jīng)不同GC含量DNA樣本的驗(yàn)證，無(wú)偏好性或僅具有極低的偏好性。本試劑盒提供的所有試劑盒組分，都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量與功能驗(yàn)證，zui高程度保障產(chǎn)品優(yōu)異性能與批間穩(wěn)定性。

產(chǎn)品組分

注意：*測(cè)序時(shí)Index序列N501-TAGATCGC，N701-TAAGGCGA，N702-CGTACTAG。

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。所有組分-20°C保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打或輕輕振蕩混勻，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫(kù)產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請(qǐng)更換槍頭。試劑吸取時(shí)應(yīng)保證槍頭適當(dāng)深入液體，排出時(shí)應(yīng)確認(rèn)槍頭無(wú)殘留。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；使用的移液器等設(shè)備；并定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

二、關(guān)于產(chǎn)品原理

本產(chǎn)品基于轉(zhuǎn)座酶法開發(fā)，其核心原理是轉(zhuǎn)座酶及其轉(zhuǎn)座ji制。在Transposome Mix中包含由轉(zhuǎn)座酶和兩種等摩爾的接頭Adapter 1和Adapter 2構(gòu)成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座發(fā)生時(shí)，該轉(zhuǎn)座子將Adapter 1和Adapter 2接頭序列插入靶基因中，形成一端帶有Adapter 1，一端帶有Adapter 2的DNA，之后利用DNA聚合酶將轉(zhuǎn)座形成的切口補(bǔ)齊。這種產(chǎn)物經(jīng)N5（N5XX）和N7（N7XX）以及P5和P7（PCR Primer Mix）兩對(duì)引物擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)分選和純化后即為可測(cè)序文庫(kù)。

圖1  Fast Tagment DNA建庫(kù)試劑盒原理

三、關(guān)于DNA  pian段化（DNA Tagment）

1. 本試劑盒使用轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行DNA  pian段化。如DNA樣品為PCR產(chǎn)物，應(yīng)保證其長(zhǎng)度>500 bp。因轉(zhuǎn)座酶無(wú)法作用于DNA末端，因此PCR產(chǎn)物末端50 bp測(cè)序覆蓋度可能會(huì)有所降低。我們推薦您在制備PCR產(chǎn)物時(shí)將待測(cè)區(qū)域兩末端各延長(zhǎng)50-100 bp，以避免末端測(cè)序覆蓋度降低的情況。

2. 本試劑盒適用50 ng Input DNA。在Input DNA投入前，應(yīng)將其純化并溶于滅菌蒸餾水中，A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0，并使用基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等進(jìn)行定量?！咀⒁猓阂騎ransposome Mix對(duì)DNA濃度非常敏感，所以準(zhǔn)確的DNA濃度測(cè)定對(duì)實(shí)驗(yàn)成功與否至關(guān)重要。】

四、關(guān)于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

2. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

3. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫(kù)質(zhì)量。

4. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

5. 磁珠使用過程中，應(yīng)保證移液準(zhǔn)確性。

6. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無(wú)水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長(zhǎng)度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產(chǎn)物于4°C可保存1周，-20°C可保存1個(gè)月。

五、關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

1. 使用本試劑盒必須進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增步驟。因轉(zhuǎn)座反應(yīng)產(chǎn)物并非完整的雙鏈DNA文庫(kù)，必須通過PCR反應(yīng)生成完整的DNA文庫(kù)。

2. 當(dāng)Input DNA量為50 ng時(shí)，推薦使用5-9個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，7個(gè)循環(huán)的文庫(kù)產(chǎn)出約為900 ng。

六、關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

2. 文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫(kù)濃度檢測(cè)：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí)，無(wú)法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(kù)（即可測(cè)序的文庫(kù)），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾。

4. 文庫(kù)濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè)，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. 文庫(kù)質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. N5（N5XX）和N7（N7XX）Index引物： Hieff NGS^® Tagment Index Kit for Illumina^® (96 Index)（Cat#12610ES96）。

4. 其他材料：無(wú)水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

圖2  Fast Tagment DNA建庫(kù)試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 DNA pian段化（DNA Tagment）

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。將5×Reaction Buffer、6×Terminate Solution室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無(wú)菌PCR管中配制表1所示反應(yīng)體系。

表1  片段化反應(yīng)體系

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表2所示反應(yīng)程序，進(jìn)行片段化反應(yīng)。

表2  片段化反應(yīng)程序

5. 終止反應(yīng)：立即向反應(yīng)物中加入10 μL 6×Terminate Solution，使用移液器輕輕吹打混勻，短暫離心，55℃反應(yīng)10 min，如表3。

表3  終止反應(yīng)程序

6. 片段化產(chǎn)物純化

1）將平衡至室溫的Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠，振蕩或上下顛倒混勻，以1.0×比例回收上述片段化產(chǎn)物。

2）吸取60 μL磁珠加入上述60 μL片段化產(chǎn)物中，使用移液槍輕輕吹打混勻，室溫孵育5 min。

3）將PCR管短暫離心并置于磁力架上分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

4）保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后小心移除上清。

5）重復(fù)步驟4），總計(jì)漂洗兩次。

6）保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

7）將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL滅菌超純水洗脫。渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置孵育5 min。

8）將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清（約5 min）后小心吸取20 μL上清至干凈的滅菌PCR管中。

7. 立即進(jìn)行步驟3.2，文庫(kù)PCR富集。

3.2 文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

1. 將表4中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無(wú)菌PCR管中配制表4所示反應(yīng)體系。

表4  PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

注意：*Hieff NGS^® Tagment Index Kit for Illumina^® (96 Index)（Cat#12610ES96）中提供8種N5XX和12種N7XX，可根據(jù)樣品數(shù)量和Index選擇策略自行選擇。

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表5所示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表5  PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

注意：*此步不可省略。轉(zhuǎn)座反應(yīng)產(chǎn)物并非完整的雙鏈DNA，72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。

**循環(huán)數(shù)請(qǐng)根據(jù)測(cè)序需要進(jìn)行選擇。起始DNA量為50 ng時(shí)，推薦5-9個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。

3.3 文庫(kù)純化或分選（Library Clean Up/Size Selection）

如對(duì)文庫(kù)長(zhǎng)度分布無(wú)特殊要求，可直接使用1.0×磁珠純化擴(kuò)增產(chǎn)物（參照步驟3.1中6.片段化產(chǎn)物純化步驟），而不進(jìn)行片段分選。如需進(jìn)行片段分選，則進(jìn)行以下步驟，推薦使用Cat#12601 DNA Selection Beads進(jìn)行產(chǎn)物片段分選，為防止接頭或大片段殘留，可進(jìn)行兩次片段分選，或先使用1.0×磁珠純化擴(kuò)增產(chǎn)物后再進(jìn)行分選。

1. 將平衡至室溫的Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠，振蕩或上下顛倒混勻。

2. 根據(jù)DNA  pian段長(zhǎng)度要求，進(jìn)行雙輪分選時(shí)，需將初始DNA樣本用滅菌蒸餾水補(bǔ)齊至100 μL，參考表6推薦比例向文庫(kù)上清中加入第—輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫孵育5 min?！咀⒁猓阂騊CR過程中樣品揮發(fā)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物體積不足50 μL，進(jìn)行下面操作之前必須使用滅菌蒸餾水將體積補(bǔ)齊至100 μL，否則分選長(zhǎng)度會(huì)與預(yù)期不一致?！?/span>

表6  磁珠文庫(kù)分選推薦比例

注意：“×"數(shù)均根據(jù)PCR產(chǎn)物體積補(bǔ)齊至100 μL計(jì)算而得，如“0.6×"表示0.6×100 μL = 60 μL。

3. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。

4. 參考表6向上清中加入第二輪分選磁珠。

5. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

6. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

7. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

8. 重復(fù)步驟7，總計(jì)漂洗兩次。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

10. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

11. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中，于-20℃保存。此外，如需獲得長(zhǎng)度分布更集中的文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物，可使用膠回收方式進(jìn)行長(zhǎng)度分選和純化；如對(duì)文庫(kù)長(zhǎng)度分布范圍等無(wú)特殊要求，擴(kuò)增產(chǎn)物也可不進(jìn)行長(zhǎng)度分選，直接使用磁珠或柱純化試劑盒進(jìn)行純化。

3.4 文庫(kù)質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)來進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體請(qǐng)參見注意事項(xiàng)六。

3.5 參考實(shí)例

使用Hieff NGS^® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina^®對(duì)50 ng嗜鹽桿菌gDNA樣本建庫(kù)，并分別使用1.0×磁珠進(jìn)行純化，0.8×/0.2×、0.7×/0.2×、0.5×/0.15×磁珠比例進(jìn)行長(zhǎng)度分選，結(jié)果使用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行檢測(cè)。

圖3  Agilent 2100 Bioanalyzer文庫(kù)質(zhì)量分析

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