產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)180-200 bp的DNA ladder。

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Alexa Fluor 640)可以用來檢測組織細(xì)胞在凋亡晚期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因組DNA斷裂時(shí)暴露出的3′-羥基（3′-OH）末端摻入Alexa Fluor 640-12-dUTP，從而可以用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測。Alexa Fluor 640為紅色熒光染料，具有很高的穩(wěn)定性和很強(qiáng)的亮度。

本試劑盒應(yīng)用范圍廣，可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。

本試劑盒儲(chǔ)存在-20℃，Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix避光儲(chǔ)存于-20℃，保質(zhì)期為1年。

注意事項(xiàng)

1）需自備用于洗滌細(xì)胞的PBS，用于封片的抗熒光淬滅封片液，用于固定的4%多聚甲醛。

2）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

操作步驟

一、樣品準(zhǔn)備

A．  石蠟包埋組織切片

1）室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5 min，重復(fù)一次，以*脫掉石蠟。

2）室溫下用100%乙醇浸泡切片5 min，重復(fù)一次。

3）室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3 min。
4）用PBS浸泡潤洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時(shí)，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。

5）按1:100的比例，用PBS稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液，使其終濃度為20 μg/mL。
6）每個(gè)樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育20 min?！咀ⅰ浚?/span>Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對(duì)后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時(shí)間過長會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。未得到更好的結(jié)果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間。
7）用PBS溶液潤洗樣本2-3次，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持濕潤。

B．  組織冰凍切片

1）取出冰凍切片，并回溫至室溫。將玻片浸沒在4%多聚|甲|醛溶液（溶于PBS）中固定，室溫下孵育30 min。

2）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

3）將玻片浸沒在PBS溶液中，室溫孵育15 min，重復(fù)用PBS清洗1次，共2次。
4）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時(shí)，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。

5）按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液，使其終濃度為20 μg/mL。
6）每個(gè)樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育10 min?！咀ⅰ浚?/span>Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對(duì)后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時(shí)間過長會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。未得到更好的結(jié)果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間。

7）于盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次。

【注】：為了避免在清洗步驟中的樣本脫片損失，建議不用洗瓶清洗，而是將玻片浸在PBS溶液中2-3次進(jìn)行清洗。

8）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持濕潤。

C. 細(xì)胞樣品

【細(xì)胞爬片的準(zhǔn)備】：在Lab-Tek載波片小室（Chamber Slides）上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。在凋亡誘導(dǎo)處理之后，用PBS洗2遍載玻片。

【細(xì)胞涂片的制備（以多聚賴氨酸包被的載玻片為例）】

多聚賴氨酸包被的載玻片的準(zhǔn)備：吸取50-100 μL 0.01%(w/v)多聚賴氨酸水溶液滴至每一片預(yù)清洗過的玻璃載玻片的表面。在將要用于固定細(xì)胞的區(qū)域?qū)⒍嗑圪嚢彼崛芤和可橐槐印４d玻片晾干之后，迅速用去離子水漂洗，然后讓包被后的載玻片在空氣中晾干30-60 min。包被后的載玻片能在室溫儲(chǔ)存數(shù)月。以約2×10⁷個(gè)細(xì)胞/mL的濃度將細(xì)胞重懸于PBS中，吸取50-100 μL細(xì)胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上，用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細(xì)胞懸液。

按照以下步驟對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行處理：

1）固定細(xì)胞，將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25 min。

2）洗滌載玻片，將其浸入PBS中，室溫放置5 min。重復(fù)用PBS洗一次。
3）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時(shí)，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。

4）按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液，使其終濃度為20 μg/mL。
5）每個(gè)樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育5 min（也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中，室溫孵育5 min進(jìn)行通透處理）?！咀ⅰ浚篜roteinase K幫助組織和細(xì)胞對(duì)后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時(shí)間過長會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。未得到更好的結(jié)果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時(shí)間。

6）PBS潤洗樣本2-3次。輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中。

二、DNA酶處理陽性對(duì)照的步驟

在樣本通透處理后，用DNA酶I處理細(xì)胞來準(zhǔn)備陽性對(duì)照載玻片。該流程通常會(huì)引起被處理的大多數(shù)細(xì)胞顯現(xiàn)熒光。

【注】：DNA酶I處理固定的細(xì)胞會(huì)引起染色體DNA的斷裂，產(chǎn)生許多可標(biāo)記的DNA 3’-末端。
1） 按1:10的比例用去離子水稀釋10×DNase I Buffer(每個(gè)樣本需用200 µL 1×DNase I Buffer，即需要用20 µL 10×DNase I Buffer和180 µL去離子水混合稀釋)，取其中100 µL滴加到已通透的樣本上，室溫孵育5min。向剩余100 μL 1×DNase I Buffer中加1 μL DNase I (1U/ μL)，使其終濃度為10 U/mL。

2）輕輕叩掉液體，加入100 μL含10U/mL DNase I 的緩沖液，室溫孵育10 min。

3）輕叩載玻片，去掉多余的液體，并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中*洗3-4次。

【注】：陽性對(duì)照載玻片必須使用單獨(dú)的染色缸，否則陽性對(duì)照載玻片上殘余的DNase I 可能會(huì)在實(shí)驗(yàn)載玻片上引入高背景。

三、標(biāo)記與檢測

1）按1:5的比例用去離子水稀釋5×Equilibration Buffer（每個(gè)樣品需要100 μL 1×Equilibration Buffer）。
2）每個(gè)樣本滴加100 μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域，室溫孵育10-30 min?；蛘邔⑤d玻片放入一個(gè)含1×Equilibration Buffer的缸中，保證緩沖液沒過樣本。在平衡細(xì)胞的同時(shí)在冰上解凍Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix，并且依照表1，準(zhǔn)備足夠量的用于所有實(shí)驗(yàn)的和可選陽性對(duì)照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對(duì)于面積小于5 cm²的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)，其體積是50 μL，用50 μL乘以實(shí)驗(yàn)和陽性對(duì)照反應(yīng)的數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。對(duì)于表面積更大的樣本，可成比例的增大試劑體積。

表1.準(zhǔn)備用于實(shí)驗(yàn)的和可選陽性對(duì)照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液

陰性對(duì)照體系：準(zhǔn)備一份不含TdT酶的對(duì)照孵育緩沖液，用ddH₂O替代TdT酶。

3）在平衡后的區(qū)域周圍用吸水紙洗掉100 μL 1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在5cm²面積的細(xì)胞上加入50 μL TdT孵育緩沖液。不要讓細(xì)胞干掉。這之后的操作，載玻片要避光。

4）把塑料蓋玻片（或封口膜）蓋在細(xì)胞上以保證試劑的平均分布，在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于濕盒內(nèi)，在37℃孵育60 min。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光。

【注】：塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。
    5）移除塑料蓋玻片（或封口膜），并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5 min，換用新鮮PBS重復(fù)2次。

6） 用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。【注】：為了降低背景，載玻片在用PBS洗一遍后，可再用含0.1% Triton X-100和5 mg/mL BSA的PBS洗3次，每次5 min，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈。

7）樣本在染色缸中染色，在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液的染色缸，室溫放置5 min。DAPI溶液用PBS新鮮配制并稀釋到2 μg/mL。
8）洗滌樣本，將載玻片浸入去離子水中，室溫放置5min。重復(fù)兩次，總共洗三次。
9）擦干載玻片上多余的水并向樣品區(qū)域加100 μL PBS保持樣品濕潤。
10）立即在熒光顯微鏡下分析樣本，在620nm下檢測Alexa Fluor 640紅色熒光，在460 nm觀察藍(lán)色的DAPI。DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有Alexa Fluor 640-12-dUTP摻入而定位的紅色熒光。如有必要，載玻片能在4℃黑暗條件下存放過夜。

四、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測懸浮細(xì)胞

1）將3-5×10⁶個(gè)細(xì)胞用PBS洗兩次，每次在4℃，300×g離心10 min，然后重懸在0.5mL PBS中。

2）固定細(xì)胞，加入5 mL 1%配制于PBS中的多聚甲|醛|溶液，冰上放置20 min。

3）細(xì)胞在4℃，300×g離心10 min，去上清并且重懸于5 mLPBS。重復(fù)洗一次，并用0.5 mLPBS重懸細(xì)胞。
4）通透細(xì)胞，加入5mL冰上預(yù)冷的70%乙醇，在-20℃孵育4小時(shí)。細(xì)胞能在70%乙醇中-20℃條件下保存一周，或者，細(xì)胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透，室溫放置5 min。

5）細(xì)胞在300×g離心10 min，并用5 mL PBS重懸。重復(fù)離心，并于1 mL PBS重懸。

6）轉(zhuǎn)移2×10⁶個(gè)細(xì)胞至一個(gè)1.5 mL的微量離心管。

7）300×g離心10 min，去上清，并用80 μL 1×Equilibration Buffer重懸。室溫孵育5 min。8）在平衡細(xì)胞的同時(shí)，在冰上融解Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix，并且依照表1，準(zhǔn)備足夠量的用于所有反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對(duì)于2×10⁶個(gè)細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)，其體積是50 μL，用50 μL乘上反應(yīng)數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。
9）細(xì)胞在300×g離心10min，去上清并把沉淀重懸在50 μL TdT孵育緩沖液中，37℃孵育60 min，避光。每隔15 min用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞。

10）加入1mL 20mM EDTA終止反應(yīng)，用微量移液器輕柔混勻。
11）300×g離心10 min，去上清并把沉淀重懸在1mL配制于PBS中的0.1% Triton X-100溶液，其中含5mg/mL BSA，重復(fù)一次，總共洗2次。

12）用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞，測量620 nm的Alexa Fluor 640紅色熒光。