產(chǎn)品描述
 

潮霉素B（Hygromycin B）是由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，通過干擾70S核糖體易位和誘導對mRNA模板的錯讀而抑制蛋白合成，從而殺死原核（如細菌）、真核（如酵母菌，真菌）和高等哺乳動物真核細胞。

大腸桿菌（ Escherichia coli.）來源的潮霉素抗性基因（hyg或hph），編碼潮霉素B磷酸轉移酶，將潮霉素B轉化成不具有生物活性的磷酸化產(chǎn)物，從而起到解毒作用。針對這一原理，潮霉素B是一種非常有用的選擇性標記，用來篩選和維持培養(yǎng)成功轉染潮霉素抗性基因的原核或者真核細胞。另外，由于作用模式的差異，常與G418 (Geneticin^TM)，Zeocin™ 和Blasticidin S聯(lián)合使用進行雙抗性陽性細胞株的選擇。潮霉素B還能用作抗病毒劑，因其選擇性滲透進入病毒感染增強通透性的細胞，且具有抑制翻譯的功效。還可混合入動物飼料中起到驅(qū)蟲功能。

本品是無菌的潮霉素B溶液（50 mg/mL in PBS buffer），可直接用培養(yǎng)液稀釋使用。

產(chǎn)品性質(zhì)
 

運輸和保存方法
 

冰袋運輸。4℃或-20℃保存，避免反復凍融。有效期2年。

注意事項

1. 潮霉素B的抗性基因（hyg或hph）除了來自E. Coli.外，還發(fā)現(xiàn)于其他的菌株，包括Streptomyces hygroscopicus和Klebsiella pneumoniae。

2. 本品為有毒化合物，避免與皮膚和眼睛接觸，請小心操作。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法
 

1. 常用篩選濃度
 

潮霉素B用來篩選穩(wěn)轉株的工作濃度需要根據(jù)細胞類型，培養(yǎng)基，生長條件和細胞代謝率而變化，推薦使用濃度為50-1000 μg/mL。對于*次使用的實驗體系建議通過建立殺滅曲線（kill curve），即劑量反應性曲線，來確定蕞佳篩選濃度。

一般而言，哺乳動物細胞50-500 μg/mL；細菌/植物細胞20-200 μg/mL；真菌300-1000μg/mL。

2. 殺滅曲線的建立
 

【注意事項】：

為了篩選得到穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株，需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素低濃度，可通過建立殺滅曲線（劑量反應曲線）來實現(xiàn)，至少選擇5個濃度。

1）*天：未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過夜。

【注】：對于需要更高密度來檢測活力的細胞，可增加接種量。

2）根據(jù)細胞類型，設定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例，可設定50，100，250，500，750，1000 μg/mL。先用去離子水或者PBS buffer按照1:10的比例將母液稀釋到5 mg/mL，然后按照下表稀釋到相應濃度的工作液。

3）第二天：替換舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養(yǎng)基。每個濃度做三個平行孔。

4）接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。
5）按照固定的周期（如每2天）進行活細胞計數(shù)來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細胞的低濃度為穩(wěn)定轉染細胞篩選用的工作濃度。

3. 穩(wěn)定轉染細胞的篩選

1）轉染48 h后，用含有適當濃度的潮霉素B篩選培養(yǎng)基來傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。
【注】：細胞處于活躍分裂狀態(tài)時抗生素的殺傷效果*。則當細胞過于稠密，其效率會降低。為了得到較好的篩選效果，*將細胞稀釋至豐度不超過25%。

2）每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。

3）篩選7天后觀察并評估細胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間，這取決于宿主細胞類型，轉染，以及篩選效果。

4）挑取并轉移5-10個抗性克隆于35 mm細胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

5）之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

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