產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

DAF-2 DA即4,5-Diaminofluorescein diacetate 4,5-二氨基熒光素衍生物，是一種用于檢測一氧化氮（NO）的熒光探針。DAF-2 DA具有細(xì)胞通透性，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的的酯酶催化形成不能穿過細(xì)胞膜的DAF-2。DAF-2本身具有很弱的熒光，當(dāng)氧氣存在時(shí)，DAF-2與NO反應(yīng)生成強(qiáng)熒光的三唑熒光素（DAF-2T），激發(fā)波長為491 nm，發(fā)射波長為513 nm?？梢酝ㄟ^熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀等儀器檢測探針的熒光強(qiáng)度。DAF-2 DA是一種較靈敏的熒光探針，中性pH下NO的檢測下限可達(dá)到2-5 nM。

將該產(chǎn)品用DMSO配置成液體，100 μg的DAF-2 DA粉末溶于200 μL的DMSO中，濃度是：1 mM。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。 -20 ℃避光保存，避免反復(fù)凍融，有效期一年。

注意事項(xiàng)

1）BSA和酚紅(phenol red)對本熒光探針的檢測有干擾，需避免。

2）DAF-2 DA在低溫環(huán)境中，可能會凝固，使用前可以放在2--25 ℃水浴鍋中加熱一段時(shí)間，使其全部溶解后再使用。

3）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4）粉末溶解前請先短暫離心，以保證產(chǎn)品全在管底。

5）本產(chǎn)品僅用于科研用途，禁止用于人身上。

使用說明

1. 裝載探針

注意：

a. 拿到產(chǎn)品溶液后，建議先分裝，避光保存在-20 ℃冰箱中。稀釋后的工作液要現(xiàn)配現(xiàn)用。

b. 對于刺激時(shí)間較短（通常為2 h以內(nèi)）的細(xì)胞，先裝載探針，后用適當(dāng)?shù)年栃詫φ占白约焊信d趣的藥物刺激細(xì)胞。對于細(xì)胞刺激時(shí)間較長（通常為6 h以上）的細(xì)胞，先用適當(dāng)?shù)年栃詫φ占白约焊信d趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

c. DAF-2 DA探針的推薦使用濃度為1-10 µM，初次使用需根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)體系來進(jìn)行加載濃度，孵育時(shí)間和溫度的優(yōu)化。原則上來說，以低濃度探針檢測且產(chǎn)生足量信噪比的熒光信號為宜。另縮短孵育時(shí)間可減少亞細(xì)胞區(qū)室化現(xiàn)象。

d. 以下步驟使用的工作濃度（5 µM）和孵育時(shí)間（37 ℃，20 min）僅做參考，可根據(jù)實(shí)際情況來調(diào)整。比如，對于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)未被刺激的陰性對照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可降低DAF-2 DA的加載濃度至1-2.5 µM。相反，如果發(fā)現(xiàn)用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可升高DAF-2 DA的加載濃度為10 µM，以提高檢測的靈敏度。另外，探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15-60 min內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整，孵育溫度在4 ℃-37 ℃內(nèi)調(diào)整。

1.1原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁細(xì)胞

按照1:200的比例，用適當(dāng)?shù)木彌_溶液（PBS、HBSS、DPBS、無血清的培養(yǎng)基）稀釋DAF-2 DA（1 mM）母液，即終濃度為5 µM的工作液。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DAF-2 DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常情況下六孔板內(nèi)單孔需要約1 mL的DAF-2 DA工作液。37 ℃孵育20 min。然后用PBS（pH 7.4）洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-2 DA。

1.2收集細(xì)胞后裝載探針：本方法適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞

按照1:200比例，用適當(dāng)?shù)木彌_溶液（PBS、HBSS、DPBS、無血清的培養(yǎng)基）稀釋DAF-2 DA（5 mM），即終濃度為5 µM的工作液。細(xì)胞收集后，用稀釋好的DAF-2 DA重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×10⁶-2×10⁷/mL，37 ℃孵育20 min。上述操作可以在離心管內(nèi)進(jìn)行。每隔3-5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。然后用PBS（pH 7.4）洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DAF-2 DA。直接用適當(dāng)?shù)年栃詫φ栈蜃约焊信d趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后再刺激細(xì)胞。

2. 檢測

2.1 對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡或普通的熒光顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。

2.2 對于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測，也可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

3. 參數(shù)設(shè)置

在激發(fā)和發(fā)射波長分別為491 nm和513 nm處，實(shí)時(shí)、逐時(shí)間點(diǎn)或單時(shí)間點(diǎn)檢測刺激前后熒光的強(qiáng)弱。根據(jù)熒光強(qiáng)弱的變換，來分析判斷細(xì)胞中一氧化氮（NO）的含量高低。

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HB201217