產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

金擔子素A，又名Aureobasidin A、AbA、Basifungin、短梗霉素A，是從絲狀真菌Aureobasidium pullulans No. R106中分離出來的環(huán)酯肽類抗生素，是一種是一種環(huán)狀肽、抗真菌的抗生素，具有很強的抗真菌能力，是肌醇磷酸化神經(jīng)酰胺合成酶AUR1的抑制劑。在較低的濃度下(0.1-0.5 μg/mL)即可對酵母產(chǎn)生毒性。對其敏感的真菌種類包括：出牙酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(A. niger.)。作用機制是Aureobasidin A抑制了真菌生長所依賴的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide, IPC)合成酶的活性，干擾鞘脂合成，從而進一步殺死菌株。編碼IPC合成酶的基因研究較多的有來自釀酒酵母菌的AUR1基因，以及構(gòu)巢曲霉的AURA基因，兩者具有同源性。通過對這些編碼基因進行突變即可使得菌株對Aureobasidin A產(chǎn)生抗性，如AUR1-C基因。

Aureobasidin A非常適合用作陽性克隆子篩選用的藥物選擇性標記。Aureobasidin A抗性也是酵母單/雙雜交研究中理想的報告子。本品為溶于甲醇的Aureobasidin A溶液，濃度為1 mg/mL。具體的工作濃度取決于宿主細胞的敏感度（見表1. AbA對各種酵母菌的低抑菌濃度(MIC)）。

表1 Aureobasidin A對各種酵母菌的低抑菌濃度

產(chǎn)品性質(zhì)

運輸與保存方法

冰袋運輸。-20℃保存，有效期2年。建議分裝后-20℃干燥保存，避免反復(fù)凍融。不建議4℃和常溫下長期存放。

產(chǎn)品應(yīng)用

1. 酵母雙雜交研究

2. 酵母單雜交研究

3. 嚴格的酵母藥物選擇標記

4. Aureobasidin A抗性是酵母雜交研究的理想報告因子  

操作步驟（抗AbA的酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)）

1. 加入0.5 mL過夜培養(yǎng)的酵母到50 mL YPD培養(yǎng)基中（配方：1 L液體培養(yǎng)基含有10 g yeast extract，20 g polypeptone，20 g D-glucose；固體培養(yǎng)基另外加入2%瓊脂）。

2. 30℃培養(yǎng)約6小時，測定OD₆₆₀為1-2。使用二倍體時，測定OD₆₆₀為2-4。

3. 1,000×g離心5分鐘。

4. 用10 mL Solution A（配方：100 mM Lithium acetate，10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA）懸浮沉淀，1,000×g離心5分鐘。

5. 用Solution A重懸沉淀，直到OD₆₆₀為150。

6. 在管內(nèi)分取100 µL細胞懸浮液，30℃培養(yǎng)1小時。

7. 加入5 µg載體（環(huán)狀或線性DNA）和150 µg Carrier DNA（已經(jīng)過100℃加熱10分鐘，并迅速冷卻）。

注：pAUR101需使用線性DNA進行轉(zhuǎn)化。使用環(huán)狀DNA會降低轉(zhuǎn)化效率甚至轉(zhuǎn)化不成功。pAUR112和pAUR123需使用完整的質(zhì)粒DNA進行轉(zhuǎn)化。

8. 加入850 µL Solution B（配方：取40 g Polyethylene Glycol 4000溶于100 mL Solution A充分溶解，需要現(xiàn)用現(xiàn)配），輕輕混勻。

9. 30℃培養(yǎng)30分鐘后，42℃培養(yǎng)15分鐘。

10. 室溫放置10分鐘。

11. 5,000 rpm離心1分鐘，用5 mL YPD培養(yǎng)基懸浮沉淀。

12. 30℃培養(yǎng)6小時~過夜。

13. 5,000~10,000 rpm離心，用1-10 mL 0.9% NaCl懸浮沉淀。

14. 在YPD選擇培養(yǎng)基平板（含一定濃度的AbA，依菌株類型而定）上接種100 µL細胞懸液。30℃培養(yǎng)3-4天后轉(zhuǎn)化完成。

15. 挑取陽性轉(zhuǎn)化子，和/或測定轉(zhuǎn)化效率（以每微克質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的菌落數(shù)來表示）。

注意事項

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 本產(chǎn)品僅用于科研用途，禁止用于人身上。

3. AbA的最佳工作濃度因宿主細胞不同而有差異，可根據(jù)低抑菌濃度(MIC)來確定。

使用濃度

【具體使用濃度請參考相關(guān)文獻，并根據(jù)自身實驗條件（如實驗?zāi)康?，細胞種類，培養(yǎng)特性等）進行摸索和優(yōu)化。】

使用方法（數(shù)據(jù)來自于公開發(fā)表的文獻，僅供參考）

細胞實驗（體外實驗）

Aureobasidin A通過神經(jīng)酰胺毒性和必需肌醇磷酸化神經(jīng)酰胺的抑制而抑制酵母細胞的生長。^[1]

利用合適的酶切位點將所有DNA片段克隆到Y(jié)1H載體pAbAi中，根據(jù)酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)2手冊(Clontech, Mountain View, USA)，將構(gòu)建好的pAbAi用BstbI線性化，轉(zhuǎn)化到釀酒酵母Y1HGold菌株。攜帶目的DNA片段的克隆在添加了Aureobasidin A (濃度為100-900 ng/mL)的合成脫落培養(yǎng)基上成功進行篩選。^[2]

將SlBES1基因的開放閱讀框(ORFs)擴增并連接到pGBKT7-GAL4BD質(zhì)粒中， 將融合蛋白GAL4BD-SlBES1轉(zhuǎn)化至Y2H金酵母細胞中，SD/?Trp培養(yǎng)基用于培養(yǎng)酵母轉(zhuǎn)化，用X-α-gal鑒定轉(zhuǎn)化子α-半乳糖苷酶活性，用Aureobasidin A篩選AUR1-C的基因表達。^[3]

客戶使用本產(chǎn)品發(fā)表的文獻

研究中使用的載體pAbAi含有報告基因Ura3和對Aureobasidin A (AbA)耐藥的選擇性基因AUR1-C，將目標序列F16、F20或F73分別插入到AUR1-C基因上游的多個克隆位點。為了避免酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子與目標順式元件相互作用的干擾，事先確定用于單個酵母菌落擇的低AbA濃度。將3種酵母和含p53-AbAi陽性對照分別懸浮在0.9% NaCl中，OD₆₀₀調(diào)整為0.005。隨后，將100μL樣品涂于含0、100、200、500和1000 ng/mL AbA的SD/-Ura固體介質(zhì)(Yeasen Co., China)表面。將平板倒置，在30℃下培養(yǎng)3-5天，AbA的適宜濃度為500 ng/mL。^[4]

圖1 GmWRKY31蛋白與含有F16、F20、F73、delF16、delF20或delF73片段的酵母菌互作

參考文獻

[1] Vanessa Cerantola, et al. Aureobasidin A arrests growth of yeast cells through both ceramide intoxication and deprivation of essential inositolphosphorylceramides. Mol Microbiol. 2009 Mar;71(6):1523-37.

[2] Gong P, Song C, et al. Physalis floridana CRABS CLAW mediates neofunctionalization of GLOBOSA genes in carpel development. J Exp Bot. 2021 Oct 26;72(20):6882-6903.

[3] Su D, Xiang W, Wen L, et al. Genome-wide identification, characterization and expression analysis of BES1 gene family in tomato. BMC Plant Biol. 2021;21(1):161.

[4] Dong H, Tan J, Li M, Yu Y, Jia S, Zhang C, Wu Y, Liu Y. Transcriptome analysis of soybean WRKY TFs in response to Peronospora manshurica infection. Genomics. 2019 Dec;111(6):1412-1422. doi: 10.1016/j.ygeno.2018.09.014. Epub 2018 Sep 27. PMID: 30267765.

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