產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

該試劑盒可以將Illumina試劑盒構(gòu)建的雙鏈線性文庫轉(zhuǎn)化為兼容華大智造測序平臺的環(huán)狀ssDNA文庫。構(gòu)建的文庫可使用BGISEQ-500RS、 MGISEQ-200RS 和 MGISEQ-2000RS 進(jìn)行測序。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸。

所有組分-20°C保存，有效期1年。

*當(dāng)運(yùn)輸條件、儲存條件及使用方式都正確時(shí)，所有組分在有效期內(nèi)均能保持完整活性。

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時(shí)請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. 定時(shí)對各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

7. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

二、樣本要求及處理

2.1樣本要求

樣本為線性dsDNA文庫，接頭序列符合下列之一：

單index：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-Insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

雙index：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

線性dsDNA文庫插入片段范圍為 100 ~ 500 bp，同時(shí)主帶集中在±100 bp 以內(nèi)。

2.2 樣本量要求

根據(jù)文庫總量選擇合適的線性dsDNA投入量，詳見表1：

表1  線性dsDNA總量與濃度要求

2.3 轉(zhuǎn)換PCR

不同線性 dsDNA 文庫投入量，所需 PCR 循環(huán)也不相同，詳見表2：

表2  不同線性dsDNA投入量PCR循環(huán)數(shù)推薦表

2.4 轉(zhuǎn)換文庫pooling要求

1. 不推薦在轉(zhuǎn)換PCR前對線性dsDNA進(jìn)行pooling。

2. 需將接頭轉(zhuǎn)換 PCR 產(chǎn)物混合測序，則 Sample Barcode Pooling 應(yīng)遵循堿基平衡的原則：最佳平衡狀態(tài) ATGC 4種堿基的占比應(yīng)分別為 25% ，若不能達(dá)到 25%，則要保證每個(gè) cycle 都存在 ATGC 四種堿基序列，并且最少的堿基不應(yīng)低于 12.5%，最多的堿基不應(yīng)高于 62.5%。

3. 不同片段長度的文庫不建議 pooling 環(huán)化。

4. 若樣本所需數(shù)據(jù)量相同且長度相同，則可以等量混合，每個(gè)樣本所需的質(zhì)量按照公式1進(jìn)行計(jì)算：

公式1混合樣本中單個(gè)樣本所需質(zhì)量的計(jì)算

單個(gè)樣本所需的質(zhì)量 (ng)=1 pmol Input DNA 對應(yīng)的質(zhì)量 (ng）/混合的樣本個(gè)數(shù) N

5. 混合后接頭轉(zhuǎn)換 PCR 產(chǎn)物總量為 1 pmol，總體積最多為 40 μL；若文庫不足則用 TE buffer補(bǔ)充至 40 μL

三、關(guān)于磁珠純化（Bead-based Clean Up）

1. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會導(dǎo)致純化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

4. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過分干燥又會導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥約5 min。

5. 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于-20°C可保存1個(gè)月。

四、關(guān)于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 轉(zhuǎn)換文庫推薦使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 或 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit 等雙鏈 DNA 進(jìn)行定量， 要求最終接頭轉(zhuǎn)換 PCR產(chǎn)物的摩爾產(chǎn)量至少為 1 pmol，可根據(jù)公式2計(jì)算或參考表2。

公式2 PCR 產(chǎn)物摩爾數(shù)與質(zhì)量間的換算

1 pmol PCR 產(chǎn)物對應(yīng)的質(zhì)量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

表3  不同片段大小PCR產(chǎn)物1 pmol對應(yīng)產(chǎn)量

2. 單鏈環(huán)產(chǎn)物純化后推薦使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 單鏈 DNA 熒光染料試劑對純化后產(chǎn)物進(jìn)行定量。  
3. 單鏈環(huán)狀 DNA 產(chǎn)物純化后產(chǎn)量應(yīng)達(dá)到 60 fmol 以上方足夠一次上機(jī)測序的量，可根據(jù)公式3計(jì)算或參考表3 。

公式 3 單鏈環(huán)摩爾數(shù)與質(zhì)量間的換算
60 fmol 單鏈環(huán)對應(yīng)的質(zhì)量 (ng)=0.06×DNA 主片段大小 (bp)×0.33

表4  不同PCR產(chǎn)物片段大小對應(yīng)60 fmol單鏈環(huán)產(chǎn)量

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. 文庫質(zhì)控：Cat#12640，dsDNA HS Assay Kit for Qubit®或Cat#12642，1×dsDNA HS Assay kit for Qubit®或其他等效產(chǎn)品。

3. 單鏈環(huán)質(zhì)控：Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit或其他等效產(chǎn)品。

3. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。
二、操作流程

圖1  通用文庫轉(zhuǎn)換流程

三、操作步驟

Part A接頭轉(zhuǎn)換PCR

1.轉(zhuǎn)換PCR

該步驟對線性dsDNA文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)換-轉(zhuǎn)化為可以進(jìn)行后續(xù)環(huán)化的線性dsDNA文庫。

將表5中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

于無菌PCR管中配制表5所示反應(yīng)體系。

表5  轉(zhuǎn)換PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表6所示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表6  PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

2、轉(zhuǎn)換PCR產(chǎn)物純化

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads : DNA=0.9:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，進(jìn)行洗脫：加入32 μL TE buffer，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。

9. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移30 μL上清至干凈的管中。

3、轉(zhuǎn)換PCR產(chǎn)物質(zhì)檢

使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 等轉(zhuǎn)換PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，具體請參見注意事項(xiàng)四。

Part B 轉(zhuǎn)換文庫環(huán)化

1 變性

1. 根據(jù)文庫長度，取1 pmol 至 0.2 ml PCR 管中，用 TE Buffer 補(bǔ)充至總體積 40 μL。

4. 混勻后，在 PCR 儀上進(jìn)行 98℃變性 3 min，之后立即置于冰上，冰浴 2 min 后瞬時(shí)離心。

2 單鏈環(huán)化

1. 將表7中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表7反應(yīng)體系。

表7  單鏈環(huán)化體系

3.使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀上，按照表8所示攝制反應(yīng)程序，進(jìn)行單鏈環(huán)化反應(yīng)。

表8  單鏈環(huán)化反應(yīng)程序

3 酶切消化

1. 將表9中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表9所示反應(yīng)體系。

表9 酶切消化體系

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀上，按照表10的條件進(jìn)行反應(yīng)：

表10  酶切消化反應(yīng)程序

5. 反應(yīng)結(jié)束后，瞬時(shí)離心，立即進(jìn)行純化。

4 消化產(chǎn)物純化

該步驟使用磁珠對3.3步驟的產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化產(chǎn)物中，室溫孵育10min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約2 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入500μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入22 μL TE Buffer，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置10 min。

9. 短暫離心，將 PCR 管始終置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約 2min），將上清小心移至新 PCR 管中， -20℃保存，待制備 DNB。

5 消化產(chǎn)物質(zhì)控

使用Qubit® ssDNA Assay Kit熒光試劑對酶切消化產(chǎn)物進(jìn)行定量，具體請參見注意事項(xiàng)四。

HB220117