產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

HEK293宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒是用于定量分析檢測各種生物制品的中間品、半成品和成品中的HEK293殘留DNA含量的試劑盒。

本試劑盒采用探針法熒光定量PCR原理，可專一快速的檢測HEK293細胞的殘留DNA，其檢測限可以達到fg水平；且試劑盒中含有UDG酶，可以消除擴增產(chǎn)物帶來的污染。該試劑盒可與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（Cat#18461ES/18462ES）配套使用。

產(chǎn)品組分

【注】：本試劑盒不含ROX 參比染料，若您目前使用的Real Time PCR擴增儀需要添加ROX參比染料，推薦您購買本公司的50× ROX Reference Dye（Cat#10200ES）。

運輸和保存方法

1. Part I 組分干冰運輸，-20℃保存，有效期1年。

2. Part II 組分干冰運輸，-80℃保存，有效期1年。

3. 收到貨后，請檢查Part I 和Part II共2個組分是否齊全，并立即放入對應的保存溫度中儲存。

注意事項

1. 使用本試劑前請仔細閱讀本說明書，實驗應規(guī)范操作，包括樣本處理、反應體系的配制及加樣。

2. 加樣和配液步驟盡量都在冰上操作。

3. 每個組分在使用前都應充分震蕩混勻，低速離心。

4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。  

5. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

適用機型

包含但不限于以下儀器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500；ABI Quant Studio 5；ABI Step OnePlus.

使用方法

一、HEK293 DNA定量參考品的稀釋和標準曲線的制備

用試劑盒中提供的DNA稀釋液將DNA定量參考品進行梯度稀釋，稀釋濃度依次為300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具體操作如下：

1. 將試劑盒中的DNA定量參考品和DNA稀釋液置于冰上融化，待*融化后，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2. 取6支潔凈的1.5 mL離心管，分別標記為3 ng/μL，①，②，③，④，⑤。

3. 在標記為3 ng/μL的1.5 mL離心管中加入90 μL DNA稀釋液和10 μL DNA定量參考品（30 ng/μL），即稀釋為3 ng/μL，振蕩混勻后短時間快速離心10 sec，該濃度可分裝置于-80℃短期保存（不超過3個月），使用時避免反復凍融。

4. 在 ①，②，③，④，⑤ 管中先分別加入90 μL DNA稀釋液，再進行梯度稀釋，稀釋方法如下：

【注】：

1. 每個濃度做3個復孔，該試劑可測試30 fg/μL-300 pg/μL線性范圍。若需要，可適當擴大或縮小線性范圍。

2. 為減少反復凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時將DNA定量參考品分裝儲存于-80℃。

3. 已融化未使用的 DNA 稀釋液可保存于2-8 ℃ 7天，若長時間不用，請放置于-20℃。

4. 為確保模板*混勻，每個梯度稀釋時需輕微震蕩混勻約1 min。

二、樣本加標回收質(zhì)控QC的制備

根據(jù)需要設置QC中的HEK293 DNA標準品濃度（以制備加3 pg/μL DNA量的樣本加標回收為例），具體操作如下：

1. 取100 μL待測樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL溶液③，混勻，標記為加標回收QC。

2. 加標回收QC和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備加標回收QC純化液。

三、標準品回收質(zhì)控QC的制備（可選）

根據(jù)需要設置QC中的HEK293 DNA標準品濃度（以制備加3 pg/μL DNA量的標準品回收為例），具體操作如下：

1. 取100 μL 溶液③加入1.5 mL潔凈的離心管中，標記為標準品回收QC。

2. 標準品回收QC和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備標準品回收QC純化液。

四、陰性質(zhì)控NCS的制備

根據(jù)實驗設置陰性質(zhì)控，具體操作如下：

1. 取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或DNA 稀釋液）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標記為陰性質(zhì)控NCS。

2. 陰性質(zhì)控NCS和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NCS純化液。

五、無模板對照NTC的制備

根據(jù)實驗設置無模板對照NTC，具體操作如下：

1. 無模板對照NTC無需進行樣本前處理，在qPCR法檢測殘留DNA含量階段開始配置即可。

2. 每管或孔中的NTC樣本為20 μL Mix混合液（即16 μL HEK293 qPCR mix + 4μL HEK293 Primer&probe mix） + 20 μL DNA Dilution Buffer，建議配置3個重復孔的量。

六、反應體系

【注】：

1. 根據(jù)反應孔數(shù)計算本次所需的Mix混合液總量：Mix混合液 =（反應孔數(shù)+2）× (16+4) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個樣本做3個重復孔。

2. 加樣完成密封好管子后，請先低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，*混勻反應液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下圖為參考板位：

該示例是對HEK293殘留DNA qPCR法檢測操作的展示，檢測樣本包括：1個無模板對照NTC、5個濃度梯度的DNA標準曲線、3個樣本加標回收QC（即加樣回收QC）、3個待測樣本、3個標準品回收QC（可選）、3個陰性質(zhì)控NCS（1個即可）。建議每個樣本做3個重復孔。

七、擴增程序參數(shù)設置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）

1. 創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板。

2. 創(chuàng)建1個檢測探針，命名為“HEK293-DNA"，選擇報告熒光基團為“FAM"，猝滅熒光基團為“none"。

3. 在“Assign target (s) to the selected wells"面板中，將標準曲線孔的“Task"一欄設置為“Standard"，并且在“Quantity" 一欄分別賦值為“300000"、“30000"、“3000"、“300"、“30"（含義為每孔的DNA濃度，單位為fg/μL），并且在相應的“sample name"一欄中命名為“300 pg/μL"、“30 pg/μL"、“3 pg/μL"、“300 fg/μL"、“30 fg/μL"；將無模板對照NTC孔的“Task"一欄設置為“NTC"；將陰性質(zhì)控NCS孔、待測樣本孔、樣本加標回收QC孔的“Task"一欄設置為“Unknown"，并且在相應的“Sample Name"一欄中分別命名為“NCS"、“TS"、“QC"，之后點擊“Start Run"，開始儀器運行。

4. 擴增程序設置：設置反應體積40 μL。

八、qPCR 結(jié)果分析

1. 在“Analysis"的“Amplification Plot"面板中，系統(tǒng)會自動給出Threshold，有時系統(tǒng)給出的Threshold離基線太近，導致復孔之間Ct相差甚遠，可手動調(diào)節(jié)Threshold 至合適位置，點擊“Analyze"。此時可在“Multicomponent Plot"初步查看擴增曲線的形態(tài)是否正常。

2. 在“Analysis"的“Standard Curve"面板中，可讀取標準曲線的R2、擴增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Intercept）等。正常的標曲：R2＞0.99；擴增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)；Slope在3.4左右。

3. 在“Analysis"的“View well table"面板中，“Quantity"一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測樣本TS、樣本加標回收QC的檢測值，單位為fg/μL，后續(xù)可在檢測報告中將單位換算成pg/μL或pg/mL。

HB220518