產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

E.coli宿主細(xì)胞DNA殘留檢測(cè)試劑盒是用于定量分析檢測(cè)各種生物制品的中間品、半成品和成品中的E.coli宿主細(xì)胞DNA殘留片段含量的試劑盒。

本試劑盒采用PCR熒光探針原理，專一快速的檢測(cè)E.coli細(xì)胞的殘留DNA，其檢測(cè)限可以達(dá)到fg平。試劑盒配套有E.coli DNA Control（DNA定量參考品）。本試劑盒需要與磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（Cat#18461/18462）配套使用。

產(chǎn)品組分

【注】：適用機(jī)型（包含但不限于以下儀器）：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500；ABI QuantStudio 5；ABI StepOnePlus；

上海宏石醫(yī)療科技：SLAN-96S.

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃儲(chǔ)存，有效期2年。收到貨后，建議將D組分E.coli DNA Control儲(chǔ)存于－80℃，其它組分儲(chǔ)存于－20℃。

注意事項(xiàng)

1. 加樣和配液步驟盡量都在冰上操作。

2. 每個(gè)組分在使用前都應(yīng)充分震蕩混勻，低速離心。

3. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

使用方法

一、E.coli DNA Control的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用試劑盒中提供的DNA Dilution Buffer將E.coli DNA Control進(jìn)行梯度稀釋，稀釋濃度依次為 300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具體操作如下：

1. 將試劑盒中的E.coli DNA Control和 DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待*融化后，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2. 取6支干凈的1.5 mL離心管，分別標(biāo)記為 3 ng/μL，①，②，③，④，⑤。

3. 在標(biāo)記為3 ng/μL的1.5 mL離心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL E.coli DNA Control，即稀釋為 3 ng/μL，振蕩混勻后短時(shí)間快速離心10 sec，該濃度可分裝置于－80℃短期保存（不超過3個(gè)月），使用時(shí)避免反復(fù)凍融。

4. 在①，②，③，④，⑤管中先分別加入90 μL DNA Dilution Buffer，再進(jìn)行梯度稀釋，稀釋方法如下：

【注】：1. 每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔。該試劑可測(cè)試30 fg/μL-3 ng/μL線性范圍，如需要，可擴(kuò)大或縮小線性范圍。

          2. 為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時(shí)將DNA定量參考品分裝儲(chǔ)存于－80℃。

3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天，如長(zhǎng)時(shí)間不用請(qǐng)放置于－20℃。

4. 為確保模板*混勻，每個(gè)梯度稀釋時(shí)需震蕩混勻1 min以上。

二、加樣回收質(zhì)控QC的制備

根據(jù)需要設(shè)QC中的E.coli DNA加樣濃度（以制備加3 pg/μL DNA量的樣本QC為例），具體操作如下：

取100 μL待測(cè)樣本加入1.5 mL干凈的離心管中，再加入10 μL②，混勻，標(biāo)記為加樣回收QC。

加樣回收QC和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備加樣回收QC純化液。

三、標(biāo)準(zhǔn)品回收質(zhì)控QC的制備（可選）

根據(jù)需要設(shè)QC中的E.coli DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度（以加3 pg/μL DNA 標(biāo)準(zhǔn)品為例），具體操作如下：

取100 μL 3 pg/μL定量參考品的稀釋液加入1.5 mL干凈的離心管中，標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)品回收QC。

標(biāo)準(zhǔn)品QC和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備標(biāo)準(zhǔn)品QC純化液。

四、陰性質(zhì)控NC的制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性質(zhì)控，具體操作如下：

取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL干凈的離心管中，標(biāo)記為陰性質(zhì)控NC。

陰性質(zhì)控NC和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NC純化液。

五、反應(yīng)體系

【注】：1. 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的 qPCR MIX 總量：qPCR MIX =（反應(yīng)孔數(shù)+2）×40 μL（含有2孔的損失量）。實(shí)驗(yàn)中每一個(gè)樣品模板最好重復(fù)做3個(gè)以上。

2. 加樣完成密封好管子后，請(qǐng)先低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，*混勻反應(yīng)液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下圖為參考板位：

該示例表示的是檢測(cè)6個(gè)濃度梯度的DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線、1個(gè)無(wú)模板對(duì)照NTC、3個(gè)陰性質(zhì)控NC、3個(gè)待測(cè)樣本、3個(gè)加樣回收QC和3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品回收QC。每個(gè)檢測(cè)做3個(gè)重復(fù)孔。

六、擴(kuò)增程序參數(shù)設(shè)置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）

創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對(duì)定量檢測(cè)模板。

創(chuàng)建1個(gè)檢測(cè)探針，命名為E.coli-DNA，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，猝滅熒光基團(tuán)為none。

在Assign target (s) to the selected wells面板中，將標(biāo)準(zhǔn)曲線孔的Task一欄設(shè)置為Standard，并且在Quantity 一欄分別賦值為300000、30000、3000、300、30（含義為每孔的DNA濃度，單位為fg/μL），并且在相應(yīng)的sample name一欄中命名為300 pg/μL，30 pg/μL，3 pg/μL，300 fg/μL，30 fg/μL；將無(wú)模板對(duì)照NTC孔的Task一欄設(shè)置為NTC；將陰性質(zhì)控NC孔、待測(cè)樣本孔、樣本QC孔的Task一欄設(shè)置為Unknown，并且在相應(yīng)的Sample Name一欄中命名為NTC、NC、YP、QC，之后點(diǎn)擊 。

4. 擴(kuò)增程序設(shè)置：設(shè)置反應(yīng)體積40 μL。

七、qPCR 結(jié)果分析

在 Analysis的Amplification Plot面板中，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)給出Threshold，有時(shí)系統(tǒng)給出的Threshold離基線太近，導(dǎo)致復(fù)孔之間Ct相差甚遠(yuǎn)，可手動(dòng)調(diào)節(jié)Threshold至合適位置，點(diǎn)擊Analyze。此時(shí)可在Multicomponent Plot初步查看擴(kuò)增曲線的形態(tài)是否正常。

2. 在Analysis的Standard Curve面板中，可讀取標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2、擴(kuò)增效率（Eff%）。正常的標(biāo)曲，R2＞0.99；90%≤Eff%≤110%。

3. 在Analysis的View well table面板中，Quantity一欄可讀取無(wú)模板對(duì)照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測(cè)樣本、樣本ERC的檢測(cè)值，單位為fg/μL，后續(xù)可在檢測(cè)報(bào)告中將單位換算成pg/μL或pg/mL。

HB220322