產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

真核生物中mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾在5'端形成一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)，即帽子結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對(duì)mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)與翻譯過(guò)程均有較重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子結(jié)構(gòu)的有效酶，其由D1和D12兩個(gè)亞基組成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鳥(niǎo)苷酰基轉(zhuǎn)移酶活性和鳥(niǎo)|嘌|呤甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可將7-甲基鳥(niǎo)|嘌|呤帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp）連接到RNA的5'末端（m7Gppp5'N）。牛痘病毒加帽酶，在合適濃度的加帽緩沖液（Capping buffer），鳥(niǎo)苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲|硫|氨|酸（SAM）等存在條件下，能夠在一個(gè)小時(shí)之內(nèi)對(duì)RNA進(jìn)行加帽，并且保證正確的方向。

Capping Buffer 牛痘病毒加帽酶加帽緩沖液是經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的10×Capping Buffer，按照GMP工藝要求生產(chǎn)，產(chǎn)品以無(wú)菌液體形式提供，可應(yīng)用于體內(nèi)/體外翻譯前mRNA的加帽反應(yīng)或mRNA的5'末端標(biāo)記反應(yīng)。

產(chǎn)品性質(zhì)

【注】：具體產(chǎn)品質(zhì)檢數(shù)據(jù)及更多指標(biāo)請(qǐng)查看批次質(zhì)檢報(bào)告。

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作；

2. 所提取的RNA需經(jīng)過(guò)純化并使用無(wú)核酸酶的水重懸；

3. 在加入酶之前需要對(duì)RNA溶液進(jìn)行加熱以去除5'末端的二級(jí)結(jié)構(gòu)；

4. 對(duì)于已知5'末端結(jié)構(gòu)的RNA，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至60 min，提高加帽效率；

5. 5'末端標(biāo)記反應(yīng)體系中，GTP儲(chǔ)液應(yīng)稀釋為反應(yīng)體系中mRNA摩爾濃度的1-3倍。

Capping Buffer 牛痘病毒加帽酶加帽緩沖液

使用方法

1. 加帽反應(yīng)（反應(yīng)體系20 μL）

本步驟適用于10 μg RNA（≥ 100 nt）的加帽反應(yīng)，且可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要放大。

1）取10 μg RNA至1.5 mL離心管，使用無(wú)核酸酶的水稀釋至15 μL；

2）65℃加熱5 min；

3）取出離心管置于冰上5 min；

4）依次加入以下組分：

【注】：10×Capping Buffer配方為：0.5 M Tris-HCl，pH 8.0，50 mM KCl，10 mM MgCl2，10 mM DTT。

5）37°C孵育30 min；

6）RNA加帽完成，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. 5'末端標(biāo)記反應(yīng)（反應(yīng)體系20μL）

本步驟適用于5'末端帶有三磷酸的RNA標(biāo)記，且可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要放大，其標(biāo)記效率受反應(yīng)體系中RNA與GTP摩爾濃度比以及RNA樣本中GTP含量影響。

1）取適量RNA到1.5 mL離心管，使用無(wú)核酸酶的水稀釋至14 μL；

2）65℃加熱5 min；

3）取出離心管置于冰上5 min；

4）依次加入以下組分：

【注】：GTP mix為GTP和少量標(biāo)記物，其中GTP使用濃度參照注意事項(xiàng)5）。

5）37°C孵育30 min；

6）RNA 5'末端標(biāo)記完成，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

HB220316