嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，通過抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽性菌，各種動物和昆蟲細胞。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。作用機制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3′末端的類似物，能夠與核糖體的A位點結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點結(jié)合后，不會參與隨后的任何反應，從而導致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAC)，賦予機體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性如今普遍應用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

嘌呤霉素在細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應用與慢病毒載體的特性有關(guān)，現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因。在某些特定情況下，嘌呤霉素亦可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。

本品是無菌的、溶于蒸餾水的嘌呤霉素鹽酸鹽溶液，濃度為10 mg/mL（10 mg/mL in H2O），可直接用培養(yǎng)基或其他緩沖溶液稀釋使用，適用于細胞培養(yǎng)，常用工作濃度為1~10 µg/mL。

產(chǎn)品信息

組分信息

儲存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

使用說明

1. 建議使用濃度

哺乳動物細胞：1~10 μg/mL，最佳濃度需要殺滅曲線來確定。推薦濃度，請看表1。

大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125 μg/mL。

【注】：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，而且受宿主細胞本身的影響。

表1 嘌呤霉素鹽酸鹽的推薦濃度

2. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導為例）

嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態(tài)、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達的shRNA細胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導細胞的濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線(kill curve)。

1）Day 1：24孔板內(nèi)以5~8×104 cells/孔的密度鋪板，鋪足夠量的孔，以確保后續(xù)的梯度實驗的進行，37℃細胞孵育過夜。

2）Day 2：①準備篩選培養(yǎng)基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0~15 μg/mL，至少5個梯度）；②往孵育過夜后的細胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基；之后37℃孵育細胞。

3）Day 4：更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察細胞存活率。

4）根據(jù)細胞的生長狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基。

5）每日監(jiān)測細胞，觀察存活細胞率，確定抗生素篩選開始4~6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或所有非轉(zhuǎn)導細胞的藥物濃度。

3. 哺乳動物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選

等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后，細胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。

1）細胞轉(zhuǎn)染48 h后，將細胞（原樣或稀釋）置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

【注】：當細胞處于分裂活躍期時，抗生素作用。細胞過于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會明顯下降。最好進行細胞分盤使其密度不超過25%。

2）每隔2~3天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。

3）篩選7天后評估細胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間，這依賴于宿主細胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。

【注】：每日進行細胞生長狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48 h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。

4）轉(zhuǎn)移和放置5~10個抗性克隆到一個35 mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天。此次富集培養(yǎng)是為日后的細胞毒性實驗做準備。

注意事項

1.嘌呤霉素為有毒化合物，操作時請小心拿放。

2.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

3.本產(chǎn)品僅用于科研用途，禁止用于人身上。

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