嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)發(fā)酵代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成而殺死革蘭氏陽(yáng)性菌，各種動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。作用機(jī)制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3′末端的類(lèi)似物，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點(diǎn)結(jié)合后，不會(huì)參與隨后的任何反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAC)，賦予機(jī)體對(duì)嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性如今普遍應(yīng)用于篩選特定攜帶pac基因質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

嘌呤霉素在細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān)，現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因。在某些特定情況下，嘌呤霉素亦可以用來(lái)篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。

本品是無(wú)菌的、溶于蒸餾水的嘌呤霉素鹽酸鹽溶液，濃度為10 mg/mL（10 mg/mL in H2O），可直接用培養(yǎng)基或其他緩沖溶液稀釋使用，適用于細(xì)胞培養(yǎng)，常用工作濃度為1~10 µg/mL。

產(chǎn)品信息

組分信息

儲(chǔ)存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

使用說(shuō)明

1. 建議使用濃度

哺乳動(dòng)物細(xì)胞：1~10 μg/mL，最佳濃度需要?dú)缜€來(lái)確定。推薦濃度，請(qǐng)看表1。

大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125 μg/mL。

【注】：使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，而且受宿主細(xì)胞本身的影響。

表1 嘌呤霉素鹽酸鹽的推薦濃度

2. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)為例）

嘌呤霉素有效篩選濃度跟細(xì)胞類(lèi)型、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝情況及細(xì)胞所處細(xì)胞周期位置等有關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的濃度嘌呤霉素至關(guān)重要。建議初次做實(shí)驗(yàn)的客戶一定要建立適合自身實(shí)驗(yàn)體系的殺死曲線(kill curve)。

1）Day 1：24孔板內(nèi)以5~8×104 cells/孔的密度鋪板，鋪?zhàn)銐蛄康目?，以確保后續(xù)的梯度實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，37℃細(xì)胞孵育過(guò)夜。

2）Day 2：①準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0~15 μg/mL，至少5個(gè)梯度）；②往孵育過(guò)夜后的細(xì)胞內(nèi)更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基；之后37℃孵育細(xì)胞。

3）Day 4：更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察細(xì)胞存活率。

4）根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基。

5）每日監(jiān)測(cè)細(xì)胞，觀察存活細(xì)胞率，確定抗生素篩選開(kāi)始4~6天內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)染或所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的藥物濃度。

3. 哺乳動(dòng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選

等轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒后，細(xì)胞在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中增殖，以篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。

1）細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞（原樣或稀釋?zhuān)┲糜诤羞m當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

【注】：當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí)，抗生素作用。細(xì)胞過(guò)于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降。最好進(jìn)行細(xì)胞分盤(pán)使其密度不超過(guò)25%。

2）每隔2~3天，移除和更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。

3）篩選7天后評(píng)估細(xì)胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時(shí)間，這依賴于宿主細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染篩選效率。

【注】：每日進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48 h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。

4）轉(zhuǎn)移和放置5~10個(gè)抗性克隆到一個(gè)35 mm的培養(yǎng)皿中，用選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天。此次富集培養(yǎng)是為日后的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

注意事項(xiàng)

1.嘌呤霉素為有毒化合物，操作時(shí)請(qǐng)小心拿放。

2.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

3.本產(chǎn)品僅用于科研用途，禁止用于人身上。

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