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16814ESHieff® Fast Cell Direct Lysis set (for probe)
| 參考價(jià) | ￥625 |
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)
- 16814ES 型號(hào)
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
規(guī)格
| 40 T | 625元 | 99 件 可售 |
訪問次數(shù)：163更新時(shí)間：2024-01-16 17:42:36
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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
| 供貨周期 | 兩周 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
|---|
產(chǎn)品介紹
Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 適用于對(duì)各種動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行基因定量表達(dá)分析（如cell line 化的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞、各種干細(xì)胞、iPS 細(xì)胞等），無需提RNA，可直接進(jìn)行qPCR表達(dá)分析，用時(shí)短，操作簡(jiǎn)單，出錯(cuò)率低，最短只需1.5 h就可高效完成從模板制備到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及基因表達(dá)分析等步驟。該產(chǎn)品為探針法細(xì)胞直擴(kuò)RT-qPCR試劑盒的細(xì)胞裂解模塊，為補(bǔ)充試劑。
組分信息
組分編號(hào) | 組分名稱 | 16814ES40 | 16814ES60 |
16814-A | FCD Lysis Buffer | 2 mL | 5 mL |
16814-B | FCD Washing Buffer | 8 mL | 20 mL |
16814-C | FCD Stop Solution | 100 μL | 250 μL |
16814-D | DNase I | 80 μL | 200 μL |
儲(chǔ)存條件
16814-A和 16814-B未開封時(shí)請(qǐng)置于-25~-15℃保存，融解后置于4℃保存，注意防止污染，其余組分長(zhǎng)期保存時(shí)請(qǐng)于-25~-15℃保存，有效期1年。
使用說明
一、裂解產(chǎn)物的制備
將試劑放置室溫下融化，使用前上下顛倒，輕輕混勻，并輕微離心后使用，避免起泡。沒有混勻試劑、使用振蕩器混勻、未在冰上配置試劑等會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)性能下降。
將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中*，5000 rpm離心2 min收集細(xì)胞**，充分吸除培養(yǎng)基。若貼壁細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)，可直接吸除培養(yǎng)基。
各個(gè)孔內(nèi)加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細(xì)胞，5000 rpm離心2 min，吸盡FCD Washing Buffer。
各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室溫吸打混勻后靜置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右，即可得到裂解產(chǎn)物****，細(xì)胞數(shù)量超過1× 105 cells時(shí)可能會(huì)有裂解殘留物屬正常現(xiàn)象。
*50 μL裂解體系適配細(xì)胞數(shù)的基本要求是每孔1× 102 - 1× 105 cells，若細(xì)胞數(shù)量較多，可適當(dāng)?shù)缺壤黾覨CD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。
**不同細(xì)胞的離心條件不同，請(qǐng)使用適合于所用細(xì)胞的離心速度進(jìn)行離心。
***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依實(shí)驗(yàn)需要，加入裂解液量增大時(shí)需相應(yīng)增大FCD Stop Solution的量。
****細(xì)胞裂解產(chǎn)物溶液長(zhǎng)期保存時(shí)，請(qǐng)置于-25~-15℃。
二、反轉(zhuǎn)錄
室溫融化4× Hifair® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻，置于冰上并按下表配置反應(yīng)體系：
組分 | 體積 （μL） | 終濃度 |
4× Hifair® FCD RT Mix | 5 | 1× |
裂解產(chǎn)物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 20 | - |
表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
*避免吸入細(xì)胞碎片，推薦使用量為2 μl，最大不超過反應(yīng)體系的55%。
移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，按下表程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**：
反應(yīng)溫度 | 反應(yīng)時(shí)間 |
37℃ | 5 min |
85℃ | 5 sec |
表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序
**反轉(zhuǎn)錄溫度推薦使用37℃，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接進(jìn)行下游qRT-PCR檢測(cè)。為避免反轉(zhuǎn)錄體系對(duì)qPCR反應(yīng)的抑制，得到合適的Ct值（10-35），可將產(chǎn)物稀釋10-1000倍后使用。若短時(shí)間內(nèi)不進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，可放置于-25~-15℃保存。
三、熒光定量PCR
體系配置
使用下列組份比例配制反應(yīng)液（配制過程請(qǐng)于冰上進(jìn)行）：
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix | 12.5 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 200 nM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 200 nM |
Probe (10 μM) | 0.25-1 | 100-400 nM |
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 25 | - |
表3 qPCR反應(yīng)體系
*高濃度模板易導(dǎo)致非特異擴(kuò)增，可適當(dāng)將模板稀釋5-50倍。模板推薦用量4 μL。反應(yīng)性能較差時(shí)，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物探針濃度。
熒光定量PCR快速擴(kuò)增程序（推薦）
本產(chǎn)品推薦使用快速程序擴(kuò)增，可大大減少反應(yīng)時(shí)間。使用Tm值較低的引物難以擴(kuò)增時(shí)，可額外調(diào)整退火溫度。
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95℃ | 10 sec | 1 |
變性 | 95℃ |
| 45 |
退火/延伸** | 60℃ | 10 sec |
表4 qPCR反應(yīng)程序（快速）
**退火/延伸溫度、終延伸時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求適當(dāng)調(diào)整。 快速程序適用于絕大多數(shù)基因，個(gè)別復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)基因可嘗試常規(guī)程序。
熒光定量PCR常規(guī)擴(kuò)增程序
實(shí)驗(yàn)儀器不滿足快速反應(yīng)時(shí)間時(shí)，也可使用常規(guī)程序進(jìn)行擴(kuò)增。
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95℃ | 10 sec | 1 |
變性 | 95℃ |
| 40-45 |
退火/延伸** | 60℃ | 30 sec |
表5 qPCR反應(yīng)程序（常規(guī)）
注意事項(xiàng)
使用前，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)盡量使用無污染的耗材，避免污染。
本產(chǎn)品避免反復(fù)凍融，配制時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光照射。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
本產(chǎn)品僅作科研用途！
