單克隆抗體在抗擊病毒中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并已被證明能有效減少患者癥狀由輕癥向重癥的發(fā)展。然而，該領(lǐng)域未來(lái)的進(jìn)展取決于抗體開發(fā)的時(shí)間和技術(shù)。近日，《Nature - Scientific Report》雜志最近發(fā)表的一篇文章論證了單B細(xì)胞克隆篩選在快速、可靠地識(shí)別高親和力、強(qiáng)效的病毒（SARS-CoV-2）中和抗體方面的應(yīng)用，并解釋了如何增強(qiáng)其中和活性。

中和抗體
疫苗接種后，一般會(huì)產(chǎn)生不同類型的抗體，以中和抗體為例：中和抗體由病毒最外層的包膜或衣殼抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的一類能與病毒結(jié)合并使之喪失感染力的抗體。目前針對(duì)疫苗的研究中，中和抗體屬于研究的熱點(diǎn)，如針對(duì)S1蛋白的受體結(jié)合域（receptor-binding domain，RBD）、針對(duì)S1蛋白的N末端域（NTD）。

該研究中研究的中和抗體屬于前者，針對(duì)S1蛋白受體結(jié)合域（RBD），它可以和SARS-CoV-2的RBD區(qū)域結(jié)合，阻斷該區(qū)域與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II受體（ACE2 receptor）的結(jié)合，從而達(dá)到阻止病毒入侵細(xì)胞的功效。該類抗體是人體產(chǎn)生的最多、最主要也是阻斷病毒效果好的一類抗體。

圖1. SARS-CoV-2刺突(S)的蛋白結(jié)構(gòu)。a. SARS-CoV-2病毒粒子及其S蛋白示意圖。 E包膜，M膜，N核衣殼，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2。 b. SARS-CoV-2 S蛋白三聚體(PDB 6VXX)低溫em結(jié)構(gòu)。分別用橙色、綠色和藍(lán)色三種顏色來(lái)表示這三個(gè)亞基。 c. SARS-CoV-2 S受體結(jié)合域(RBD)和S1亞基n端結(jié)構(gòu)域(NTD)。 d. SARS-CoV-2 RBD與人ACE2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(PDB 6M0J)。人類ACE2是淺藍(lán)色的

通過(guò)單B細(xì)胞的篩選，可以更快的發(fā)現(xiàn)抗體
通過(guò)單B細(xì)胞分選，可以將抗體的發(fā)現(xiàn)過(guò)程縮短至幾周之內(nèi)。這種開創(chuàng)性的方法包括從免疫動(dòng)物或康復(fù)患者中分離活細(xì)胞，分類抗原特異性細(xì)胞亞群，并通過(guò)RT-PCR和PCR恢復(fù)成對(duì)的VH/VL抗體基因; 編碼的抗體可以被表達(dá)和表征，以確定性能較好的克隆，如圖2所示：

圖2. 從單個(gè)B細(xì)胞中分離發(fā)現(xiàn)有效的SARS-CoV-2中和抗體并進(jìn)行鑒定的方法綜述

該方法的優(yōu)點(diǎn)是使用了經(jīng)過(guò)體細(xì)胞高突變的原生抗體序列，并保留了原生VH/VL配對(duì)。此外，發(fā)現(xiàn)過(guò)程是高通量的，可以進(jìn)一步對(duì)高免疫抗體庫(kù)進(jìn)行評(píng)估。

針對(duì)SARS-CoV-2病毒的中和抗體
為了評(píng)估單B細(xì)胞篩選在分離針對(duì)SARS-CoV-2病毒的中和抗體的有效性，研究人員在HEK293T細(xì)胞中制備了一種重組形式的SARS-CoV-2受體結(jié)合域(receptor-binding domain，RBD)，并對(duì)其進(jìn)行蛋白純化。

接著對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫后，通過(guò)單細(xì)胞分選從脾臟材料中分離anti?RBD IgG1+B細(xì)胞，并處理VH /VL基因。將得到的VH/VL基因?qū)寺〉讲溉閯?dòng)物表達(dá)質(zhì)粒(含人IgG1恒定區(qū)和用于嵌合抗體表達(dá)的kappa輕鏈區(qū))中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK 293-6E細(xì)胞中。 抗體鑒定包括Protein A磁珠的純化、抗原結(jié)合能力、中和活性等性能的評(píng)估。

親和性分析
在重組抗體被生產(chǎn)出來(lái)后，必需對(duì)其的親和力進(jìn)行分析，以便進(jìn)行下游的相關(guān)應(yīng)用?？贵w親和力的檢測(cè)方法包括生物膜干涉技術(shù)（BLI）、固相放射免疫法（SP-RIA）、平衡透析法、結(jié)合抗原沉淀法、放射免疫法（RIA）、ELISA法、表面等離子共振法（SPR）。

該方法使用了結(jié)合抗原沉淀法進(jìn)行親和力的分析，將鏈霉親和素-磁珠與包被有生物素化RBD一起孵育后，洗滌去除掉未結(jié)合的抗體。接著使用Alexa Fluor®647熒光二抗（山羊來(lái)源，抗人IgG，F(xiàn)c片段特異性親和純化二抗，Jackson ImmunoResearch）進(jìn)行孵育并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，兩個(gè)克隆體(12H2和13I1)對(duì)RBD具有較低的pM EC50值，其值與先前報(bào)道的一種有效中和抗體CB6相當(dāng)（圖3）。

圖3. 分離出的抗體與SARS-CoV-2受體結(jié)合區(qū)域具有高度親和力。

特異性分析
將帶有His標(biāo)簽的SARS-CoV或SARS-CoV-2的RBD區(qū)域分別與Dynabeads™磁珠進(jìn)行孵育，以檢測(cè)中和抗體的特異性。將這兩種磁珠與不同濃度的抗體分別進(jìn)行孵育，并將未結(jié)合的磁珠洗脫。接著使用Alexa Fluor®488熒光二抗（山羊來(lái)源，抗人IgG，F(xiàn)c片段特異性親和純化二抗，Jackson ImmunoResearch）進(jìn)行孵育并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。

同時(shí)，研究人員評(píng)估了包被13I1抗體的磁珠與野生型SARS-CoV-2 S1蛋白以及兩種變體(B.1.1.7和B.1.351)的S1蛋白結(jié)合情況。具體實(shí)驗(yàn)方法是將珠子與SARS-CoV-2 S1蛋白孵育，然后添加雞屬來(lái)源的抗his標(biāo)簽抗體，并使用Alexa Fluor®647 熒光二抗（驢來(lái)源，抗雞IgY，F(xiàn)（ab’）?片段親和純化二抗，Jackson ImmunoResearch），接著進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。 

數(shù)據(jù)顯示，13I1與B.1.1.7的結(jié)合保留了下來(lái)，但與B.1.351的結(jié)合基本消失，說(shuō)明B.1.351這種變體的蛋白可能通過(guò)某種機(jī)制逃脫了SARS-CoV-2抗體的結(jié)合（圖4）。

圖4. 13I1抗體與SARS-CoV-2 S1亞基變異的親和性分析

研究還顯示，中和抗體具有較高的特異性和穩(wěn)定性。如圖5A所示，未特異性結(jié)合的抗體通過(guò)與CHO細(xì)胞中生物素化的可溶性膜蛋白孵育進(jìn)行分析，并通過(guò)流式分析法來(lái)檢測(cè)。兩種抗體：高非特異性結(jié)合（emibetuzumab）和低非特異性結(jié)合（elotuzumab），作為對(duì)照抗體。兩種對(duì)照抗體與實(shí)際藥物并不*相同，因?yàn)樗鼈兙哂袑?shí)際藥物的可變區(qū)域和共同的IgG1框架。

圖5. 中和抗體具有較高的特異性和穩(wěn)定性

中和活性
通過(guò)與顯示SARS-CoV-2刺突蛋白和包含熒光素酶編碼RNA的偽病毒顆粒共孵卵來(lái)評(píng)估每個(gè)抗體的中和活性。 將每種混合物進(jìn)行一系列稀釋，然后應(yīng)用于穩(wěn)定表達(dá)人ACE2 (SARS-CoV-2入侵宿主細(xì)胞的細(xì)胞受體)的工程HEK293T細(xì)胞，并通過(guò)檢測(cè)感染48小時(shí)后熒光素酶的相對(duì)表達(dá)量來(lái)量化假病毒的傳染性。 抗體12H2和13I1均具有亞nM的中和活性，IC50值分別為0.109和0.162 nM; 與CB6 (0.087 nM)的IC50相當(dāng)。

通過(guò)技術(shù)手段提高中和活性
為了研究合價(jià)對(duì)中和活性的影響，文章作者設(shè)計(jì)了一個(gè)四價(jià)雙可變域(DVD) 13I1抗體，并使用SARS-CoV-2假病毒試驗(yàn)與二價(jià)13I1 IgG進(jìn)行了并排比較。 DVD顯示，相對(duì)于二價(jià)13I1抗體，其中和活性增強(qiáng)(IC50值分別為0.131 nM和0.324 nM)，突顯出其作為一種治療策略的潛力。

總結(jié)
B細(xì)胞篩選已被證明可以快速識(shí)別高親和力、強(qiáng)效的SARS-CoV-2中和抗體。 此外，將其與抗體改良結(jié)合使用有望成為預(yù)防的有效策略。

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