一、免疫熒光的原理

免疫熒光（Immunofluorescence，IF）技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體再用這種熒光抗體 (或抗原) 作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色)，可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。

二、IF分類

三、IF實驗流程

1.樣品準(zhǔn)備：對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌 (1000rpm、5min) 2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。

2.固定：4%多聚甲醛 (PFA) 溶液固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3遍，每次5min。

3.通透：0.5% TritonX100，通透15-20min，PBS洗滌3遍，每次5min。

4封閉：3%牛血清蛋白 ( BSA) 室溫封閉30min-1h ，封閉的作用是可以減少一抗和二抗與非靶標(biāo)位點進(jìn)行非特異性結(jié)合時所產(chǎn)生的本底信號。

5.抗孵育：封閉過后，不用洗，直接將多余的BSA吸走，用稀釋后的一抗 (用3% BSA稀釋) 4度過夜孵育。

6.二抗孵育：PBST洗滌3遍，每次5min，洗去未結(jié)合的抗體。而后用稀釋后的二抗 ( 用3% BSA稀釋)室溫避光孵育1h，PBST洗滌3遍，每次5min。

7.細(xì)胞核染色：滴加DAPI避光染色5min，PBS洗滌3遍，每次5min (染細(xì)胞核是為了定位細(xì)胞)。

8.拍照：立即用激光共聚焦或熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，如果需要等待，則避光放在4°保存。

四、檢測方法

檢測方法分為直接檢驗和間接檢驗，我們一般多采用間接檢驗 (一抗+二抗)的方式。

五、免疫熒光雙染

在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上需要同時檢測兩種抗原時，需進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧p重免應(yīng)焚光標(biāo)記法也分為直接法和間接法。

1.直接法:將兩種不同熒光素偶聯(lián)的抗體(如抗A和抗B)以適當(dāng)比例混合，樣本孵育，潤洗，封片，鏡檢。

特點:簡便可靠，不需要考慮一抗種屬來源的問題，但靈敏度較低。

2.間接法:用未標(biāo)記的兩種一抗薄育樣本，潤洗后，加入兩種不同的熒光素偶聯(lián)的對應(yīng)二抗辯育樣本，潤洗，封片，鏡檢。

3.特點:使用此法應(yīng)注意兩種特異性一抗必須來源于不同種屬，且熒光標(biāo)記二抗、一抗的種屬要相匹配。

六、IF注意事項

1.固定時間影響熒光固定效果: 針對細(xì)胞樣品，如果用4%多聚甲醛固定，推薦固定時長15min，時間太短沒有達(dá)到固定效果時間太長會導(dǎo)致甲醛被氧化成甲酸，沒有固定作用了。

2.保持醛固定液新鮮，否則自發(fā)熒光背景會升高。

3.使用抗體時，需要查詢說明書。因為不同抗體使用場景不一樣，確認(rèn)抗體是否能用于細(xì)胞IF、冰凍切片IF、 石蠟切片IF。

4.細(xì)胞密度是整個實驗?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵點之一。如果細(xì)胞數(shù)量太多，產(chǎn)生疊加，也會影響整體熒光效果。

5.洗滌過程輕柔，防止加液過程沖力過大丟失細(xì)胞。

6.通透時間一般為15-20min，過短過長效果均不好，應(yīng)做不同時間梯度摸索。

七、IF常見問題總結(jié)

1.信號微弱或沒有信號

2.高背景

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