上周我們?yōu)榇蠹規(guī)?lái)了鐵死亡最新十篇高分文章深入解讀系列的前五篇（還沒(méi)讀的小伙伴快去圍觀：鐵死亡十篇高分文章深入解讀（上）），相信大家對(duì)鐵死亡的研究思路一定有了很多新的想法和理解，優(yōu)秀的文獻(xiàn)就像一本好書(shū)，總能讓人常讀常新。前五篇文章中，五個(gè)世界知ming的研究團(tuán)隊(duì)為我們分別展現(xiàn)了鐵死亡在腫瘤，造血干細(xì)胞，心血管疾病中的調(diào)控機(jī)制。

由于鐵死亡在抑制腫瘤中的重要作用也使得鐵死亡在近年來(lái)持續(xù)受到相當(dāng)多的關(guān)注，也為一些藥物耐受性的的癌癥和棘手的疾病提供了新的診療思路。今天我們繼續(xù)為大家介紹5篇優(yōu)秀前輩們?cè)诮曛嘘P(guān)于鐵死亡相關(guān)研究的杰出成果，讓我們一起與優(yōu)秀者同行。

以下是小編總結(jié)的已有報(bào)導(dǎo)的部分鐵死亡相關(guān)的檢測(cè)方法和指標(biāo)，更多鐵死亡相關(guān)的詳細(xì)研究或者其他的國(guó)自然熱點(diǎn)解讀請(qǐng)參與我們國(guó)自然解讀系列講座活動(dòng)（點(diǎn)擊進(jìn)入免費(fèi)報(bào)名）。

第一篇
DHODH-mediated ferroptosis defense is a targetable vulnerability in cancer

發(fā)表期刊：Nature （IF：64.8）

發(fā)表時(shí)間：2021年5月
鐵死亡是一種由過(guò)度的脂質(zhì)過(guò)氧化誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，已成為一種關(guān)鍵的腫瘤抑制機(jī)制。本文也是鐵死亡研究的經(jīng)典奠基之作，來(lái)自德克薩斯大學(xué)MD Anderson癌癥中心的甘波誼教授團(tuán)隊(duì)shou次發(fā)現(xiàn)不依賴于GPX4和FSP1之外的鐵死亡新的調(diào)控機(jī)制：DHODH在線粒體中介導(dǎo)鐵死亡調(diào)節(jié)中的重要作用。

DHODH是一種定位于線粒體內(nèi)膜外表面的酶。作者發(fā)現(xiàn)，在GPX4低表達(dá)（GPX4-low）的癌細(xì)胞中，補(bǔ)充DHO脫氫酶（DHODH）的底物和產(chǎn)物--二氫煙酸（DHO）或乳清酸（OA），可分別減輕或加強(qiáng)GPX4抑制所誘導(dǎo)的鐵死亡反應(yīng)，進(jìn)一步確定了線粒體中由DHODH介導(dǎo)的鐵凋亡防御機(jī)制：DHODH與線粒體GPX4并行運(yùn)作（但獨(dú)立于細(xì)胞質(zhì)GPX4或FSP1），通過(guò)將泛醌還原為泛醇（一種具有抗鐵死亡活性的抗氧化劑），來(lái)抑制線粒體內(nèi)膜中的鐵死亡。
 

文章的大概思路如下：
1、首先作者通過(guò)全代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，GPX4抑制劑RSL3或ML162處理癌細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致嘧啶生物合成的中間產(chǎn)物C-Asp明顯減少，而DHODH的底物和產(chǎn)物DHO和OA可以影響這一過(guò)程以及細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性，這讓作者想到DHODH可能在調(diào)節(jié)鐵死亡中具有重要的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DHODH抑制劑在GPX4-low腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)鐵死亡。

2、作者進(jìn)一步分析DHODH和GPX4之間的遺傳相互作用，通過(guò)Cancer Therapeutics Response Portal【1】作者發(fā)現(xiàn)DHODH的表達(dá)與GPX4抑制劑的耐藥性相關(guān)，在GPX4敲除或者GPX4-low腫瘤細(xì)胞中，去除DHODH會(huì)顯著增加脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡。DHODH和GPX4協(xié)同抑制鐵死亡。

3、由于DHODH是一個(gè)位于線粒體內(nèi)膜外表面的酶，作者繼續(xù)研究DHODH在線粒體中如何介導(dǎo)鐵死亡。在HT-1O80（GPX4-KO）細(xì)胞中，線粒體定位的GPX4（GPX4mito）而不是細(xì)胞質(zhì)定位的GPX4（GPX4-cyto）可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)DHODH抑制的敏感性。同時(shí)抑制GPX4和DHODH，可以誘導(dǎo)線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化。DHODH和線粒體GPX4可以協(xié)同抑制線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡，而不是細(xì)胞質(zhì)GPX4和FSP1。

作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，DHODH抑制線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡依賴于泛醌CoQ。泛醇COQ2是參與泛醌（CoQ）生物合成的關(guān)鍵酶，抑制DHODH能顯著提高CoQ/CoQH2的比率。結(jié)果表明，添加CoQH2類似物會(huì)抑制線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡，DHODH將線粒體中的CoQ還原成CoQH2以抑制腫瘤細(xì)胞中的鐵死亡。

4、作者進(jìn)一步驗(yàn)證DHODH抑制劑治療GPX4-low腫瘤的可能性。單獨(dú)使用DHODH抑制劑brequinar或敲除GPX4不會(huì)影響HT-1080移植瘤的生長(zhǎng)，但敲除GPX4會(huì)增加HT-1080移植瘤對(duì)DHODH抑制劑敏感性；brequinar可以顯著抑制GPX4-low移植瘤的生長(zhǎng)，而這種抑制可以被liproxstatin-1逆轉(zhuǎn)。brequinar和sulfasalazine（一種鐵死亡誘導(dǎo)劑）聯(lián)合使用可協(xié)同誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)并抑制HT-1080移植瘤的生長(zhǎng)。綜上，DHODH抑制劑可作為治療GPX4-low癌癥的潛在藥物，而DHODH抑制劑與sulfasalazine聯(lián)用可治療GPX4-high的癌癥。 

綜上所述：作者通過(guò)一系列研究表明DHODH在線粒體中對(duì)鐵死亡調(diào)控的重要作用。DHODH抑制劑和其他鐵死亡誘導(dǎo)藥物聯(lián)合使用也為腫瘤治療提供新的思路。

使用到的技術(shù)主要有：基因編輯，代謝組學(xué)分析，細(xì)胞活力檢測(cè)，熒光定量PCR，移植瘤模型

【1】Basu A et al. An interactive resource to identify cancer genetic and lineage dependencies targeted by small molecules. Cell 154, 1151–1161 (2013). [PubMed: 23993102] 

第二篇
Ferroptosis of tumour neutrophils causes immune suppression in cancer
發(fā)表期刊：Nature （IF：64.8）

發(fā)表時(shí)間：2022年11月

鐵死亡（Ferroptosis）是一種鐵依賴性的細(xì)胞程序性死亡，由調(diào)節(jié)氧化還原機(jī)制的失調(diào)觸發(fā)，最終導(dǎo)致大量多不飽和磷脂過(guò)氧化。鐵死亡誘導(dǎo)劑在體外能有效殺傷腫瘤細(xì)胞的研究比較多，而且大多數(shù)研究都集中在免疫缺陷型小鼠上，但是對(duì)免疫小鼠的研究較少。因此，免疫細(xì)胞的鐵死亡作用不得而知。來(lái)自美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)的Dmitry I. Gabrilovich研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在免疫正常的宿主中，PMN-MDSCs的鐵死亡通過(guò)限制抗腫瘤免疫來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

病理激活的中性粒細(xì)胞(PMN)，也被稱為髓系衍生抑制細(xì)胞(PMN-MDSCs)，是抗腫瘤免疫的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子。作者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中PMN-MDSCs會(huì)被鐵死亡誘導(dǎo)死亡。減少PMN-MDSCs后，鐵死亡會(huì)誘導(dǎo)氧化的脂質(zhì)的釋放和限制T細(xì)胞的活性。在免疫活性小鼠中，抑制鐵死亡可以逆轉(zhuǎn)PMN-MDSCs活性的抑制，減慢腫瘤進(jìn)程和抑制腫瘤生長(zhǎng)。而誘導(dǎo)鐵死亡會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。

文章的大概思路如下：
1、首先作者對(duì)腫瘤PMN-MDSC進(jìn)行單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)很多和鐵死亡調(diào)節(jié)相關(guān)的基因上調(diào)，作者猜測(cè)這些細(xì)胞是不是對(duì)鐵死亡具有易感性。此外，作者比較了骨髓，脾臟和腫瘤組織分離的PMN-MDSCs對(duì)鐵死亡的敏感性。結(jié)果表明，在腫瘤PMN-MDSCs中觀察到花生四烯酸AA-PEox的積聚；用鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3處理后，腫瘤PMN-MDSCs對(duì)RSL3的敏感性明顯高于骨髓和脾臟的PMN-MDSCs。在腫瘤PMN-MDSCs中，與鐵死亡激活相關(guān)的氧化PE含量明顯升高，而凋亡相關(guān)的指標(biāo)沒(méi)有變化。綜上，腫瘤組織發(fā)生鐵死亡并且鐵死亡是腫瘤PMN-MDSCs的一種主要的細(xì)胞死亡程序。

2、作者繼續(xù)研究鐵死亡是否對(duì)非免疫抑制的PMN具有抑制功能。作者用RSL3處理骨髓PMNs后發(fā)現(xiàn)過(guò)夜后大部分PMN死亡，并且導(dǎo)致PMEL CD8+ T細(xì)胞的增殖減少。此外，RSL3處理的PMN上清液對(duì)PMEL脾細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。使用了鐵死亡誘導(dǎo)劑IKE和鐵死亡抑制劑Liproxstatin-1處理骨髓PMN，發(fā)現(xiàn)IKE對(duì)PMN活性的影響不大，但仍抑制T細(xì)胞的增殖，這種抑制作用被Liproxstatin-1逆轉(zhuǎn)。

為了驗(yàn)證鐵死亡在癌癥患者PMN-MDSC介導(dǎo)的抑制中的作用，作者從頭頸癌和子宮癌患者的腫瘤組織中分離出PMN-MDSC，使用Liproxstatin-1處理后，PMN-MDSC抑制活性顯著降低。此外，作者還評(píng)估了鐵死亡誘導(dǎo)對(duì)外周血中分離的PMN的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IKE處理的PMN可有效抑制CD3/CD28誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。綜上所述，鐵死亡賦予了PMNs免疫抑制活性。

3、為了檢測(cè)鐵死亡誘導(dǎo)過(guò)程中PMN的改變，作者對(duì)RSL3或者saturosporine處理的BM PMN進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組RNA序列分析。RSL3的處理會(huì)使鐵死亡相關(guān)的基因上調(diào)。促鐵死亡相關(guān)的基因敲除后，PMN-MDSC抑制減少。AA-PEox是鐵死亡的特征指標(biāo)。在脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FATP2缺失的PMN-MDSCs中，鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)以及氧化AA-PEox的水平顯著降低。此外，RSL3誘導(dǎo)了PMNs中PEox的積累，然而，這種效應(yīng)在缺乏FATP2的細(xì)胞中不存在，因此，F(xiàn)ATP2的上調(diào)可能在PMNs鐵死亡誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。

4、作者繼續(xù)研究藥物抑制鐵死亡對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)用Liproxstatin-1處理后的小鼠腫瘤明顯減少，這表明抑制鐵死亡會(huì)導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)明顯減少。然而，在免疫缺陷的小鼠中，Liproxstatin-1的治療效果被逆轉(zhuǎn)，表明該治療對(duì)免疫系統(tǒng)有很強(qiáng)的依賴性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，liproxstatin-1增強(qiáng)了PD-1抗體阻斷免疫檢查點(diǎn)的抗腫瘤作用。使用IKE處理后導(dǎo)致CT26腫瘤生長(zhǎng)略有增加，表明促進(jìn)鐵死亡會(huì)加劇腫瘤的生長(zhǎng)。此外，鐵死亡抑制與抗PD-1協(xié)同作用，能夠顯著抑制胰腺腫瘤生長(zhǎng)，這表明即使在對(duì)免疫治療有耐藥性的腫瘤中，Liproxstatin-1也能增強(qiáng)PD1抗體的作用。

綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)鐵死亡是PMN-MDSCs在腫瘤微環(huán)境中的一種du特的、有針對(duì)性的免疫抑制機(jī)制，作者以du特的視角展現(xiàn)了鐵死亡對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，在鐵死亡藥物研發(fā)中也需要考慮不同種類細(xì)胞鐵死亡造成的不同影響。

使用到的技術(shù)主要有：流式細(xì)胞術(shù)，scRNA-seq分析，代謝組學(xué)，ELISA，LC-MS分析 

第三篇
Microglia ferroptosis is regulated by SEC24B and contributes to neurodegeneration

發(fā)表期刊：Nature Neuroscience （IF：25）

發(fā)表時(shí)間：2022年12月

鐵元素是大腦中含量豐富的轉(zhuǎn)運(yùn)金屬，研究顯示許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病進(jìn)程都和鐵穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)，包括帕金森癥（PD）和肌萎suo性側(cè)索硬化癥（ALS）等等。小膠質(zhì)細(xì)胞在所有腦細(xì)胞類型中具有最高的鐵儲(chǔ)存量并且在疾病進(jìn)程中也會(huì)有鐵積累的現(xiàn)象。但是鐵積累是否會(huì)影響小膠質(zhì)細(xì)胞的功能并且是否在神經(jīng)退行性疾病中有作用呢？美國(guó)賽諾菲公司的Timothy R. Hammond?團(tuán)隊(duì)研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞中鐵超載和鐵死亡在神經(jīng)退行性疾病中起到了關(guān)鍵作用。

鐵失調(diào)與包括帕金森病（PD）在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。在受到感染的大腦區(qū)域經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)鐵的積累，但鐵的積累是如何影響小膠質(zhì)細(xì)胞的生理機(jī)能并導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變的機(jī)制還少有研究。本篇文章中作者展示了人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)鐵具有高度反應(yīng)性，并且易受到鐵死亡的影響。此外，鐵超載會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞與PD患者的小膠質(zhì)細(xì)胞重疊的轉(zhuǎn)錄組部分發(fā)生改變，這種小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變。為了闡明調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞中調(diào)節(jié)鐵反應(yīng)的機(jī)制，作者進(jìn)行了全基因組 CRISPR 篩選，發(fā)現(xiàn)了新的鐵死亡調(diào)節(jié)因子，包括囊泡運(yùn)輸基因 SEC24B。這些數(shù)據(jù)表明，小膠質(zhì)細(xì)胞中鐵超載和鐵死亡在神經(jīng)退行性疾病中起到了關(guān)鍵作用。

文章大概思路如下：
1、為了更好的了解大腦中鐵信號(hào)通路的作用和鐵死亡機(jī)制，作者建立了3種細(xì)胞的共培養(yǎng)，包括大約15%小膠質(zhì)細(xì)胞，25%神經(jīng)細(xì)胞和60%星形膠質(zhì)細(xì)胞，然后用鐵離子和RSL3（鐵死亡誘導(dǎo)劑）處理。結(jié)果表明，三種細(xì)胞中小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)鐵離子最敏感，可能在鐵死亡過(guò)程中起到重要的作用。
2、鐵死亡究竟對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞有什么影響呢？作者繼續(xù)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，鐵元素會(huì)使小膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)發(fā)生改變。在經(jīng)過(guò)鐵離子和RSL3處理后，小膠質(zhì)細(xì)胞中的FTH蛋白水平明顯上調(diào)。此外，鐵超載會(huì)誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生和釋放的改變，從而影響疾病中的病理環(huán)境。將小膠質(zhì)細(xì)胞與其他神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果不加入小膠質(zhì)細(xì)胞的情況下，鐵死亡明顯降低。小膠質(zhì)細(xì)胞存在的情況下神經(jīng)元脂質(zhì)過(guò)氧化也會(huì)明顯增加。
3、小膠質(zhì)細(xì)胞在鐵死亡誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病中起到重要的作用。通過(guò)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的亞群分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞亞型的改變和小膠質(zhì)細(xì)胞的死亡會(huì)引起神經(jīng)性疾病。此外，作者還通過(guò)全基因組CRISPR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的鐵死亡敏感基因SEC24B，SEC248敲除使細(xì)胞對(duì)鐵死亡具有高耐受性，并且脂質(zhì)過(guò)氧化下降，表明SEC24B是小膠質(zhì)細(xì)胞中一個(gè)強(qiáng)鐵死亡調(diào)節(jié)蛋白。
4、研究了小膠質(zhì)細(xì)胞鐵死亡在神經(jīng)退行性疾病中的作用后，作者想進(jìn)一步篩選出可以抑制鐵死亡的化合物。作者使用一個(gè)商業(yè)的包含546種化合物的鐵死亡相關(guān)的文庫(kù)進(jìn)行靶標(biāo)小化合物篩選，在546中化合物中，作者篩選出39種化合物可以在小膠質(zhì)細(xì)胞中抑制鐵死亡。

綜上所述，作者對(duì)神經(jīng)退行性疾病中小膠質(zhì)細(xì)胞鐵積累的現(xiàn)象進(jìn)行具體機(jī)制的研究，揭示了小膠質(zhì)細(xì)胞鐵死亡對(duì)疾病進(jìn)程的影響。

使用到的技術(shù)主要有：scRNA-seq，Pseudo-bulk analysis，UCell analysis，Genome-wide CRISPR screen，小化合物篩選

第四篇
Ferroptosis promotes T-cell activation-induced neurodegeneration in multiple sclerosis

發(fā)表期刊：Cellular & Molecular Immunology（IF：24.1）

發(fā)表時(shí)間：2022年8月

多發(fā)性硬化癥（MS）是一種常見(jiàn)的退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘自身免疫性疾病，特點(diǎn)是T細(xì)胞，B細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。MS很容易發(fā)展成神經(jīng)退行性變并且目前并沒(méi)有g(shù)en治的方法，因此對(duì)MS中神經(jīng)元死亡的機(jī)制探究具有很重要的臨床意義。來(lái)自四川大學(xué)華西醫(yī)院雷鵬教授團(tuán)隊(duì)與胡洪波教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行深入研究并發(fā)現(xiàn)ACSL4介導(dǎo)的鐵死亡會(huì)誘導(dǎo)炎癥和促進(jìn)CNS浸潤(rùn)和T細(xì)胞激活，進(jìn)而引發(fā)EAE的神經(jīng)炎癥和脫髓鞘。

在本篇文章中，作者揭示了鐵死亡在MS中潛在的致病作用。作者發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有的MS病人的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，一個(gè)關(guān)鍵的鐵死亡蛋白（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）發(fā)生了改變，此外，在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了鐵死亡的生化特性，包括脂質(zhì)活性氧（ROS）的聚集和線粒體皺縮。使用靶向鐵死亡的抑制劑或減少ACSL4的表達(dá)可以改善EAE小鼠的行為表型，降低神經(jīng)炎癥并防止神經(jīng)元死亡。此外作者發(fā)現(xiàn)，鐵死亡是EAE的早期事件，可以在體外和體內(nèi)通過(guò)T 細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)通路促進(jìn) T 細(xì)胞活化。以上的數(shù)據(jù)共同表明鐵死亡可能是治療多發(fā)性硬化癥的潛在方法。
 
 

文章的大概思路如下：
1、作者首先在EAE小鼠中驗(yàn)證鐵死亡相關(guān)的生化指標(biāo)，結(jié)果表明鐵死亡相關(guān)的指標(biāo)包括鐵離子水平，丙二醛（MDA），脂質(zhì)ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）都明顯增加。線粒體皺縮是鐵死亡一個(gè)形態(tài)特征，也在EAE小鼠的脊髓中被觀察到。此外，作者還發(fā)現(xiàn)使用鐵死亡抑制劑抑制鐵死亡可以明顯改善EAE小鼠神經(jīng)炎癥、行為缺陷和神經(jīng)退行性變；

2、接下來(lái)，作者在EAE小鼠中驗(yàn)證鐵死亡相關(guān)關(guān)鍵基因和蛋白，作者發(fā)現(xiàn)ACSL4蛋白在EAE小鼠中含量顯著增加。?；鵆oA合成酶（ACSL4）可以將多不飽和脂肪酸活化，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞鐵死亡。接下來(lái)，作者對(duì)ACSL4基因用慢病毒進(jìn)行敲除，ACSL4敲除后顯著的改善EAE癥狀和EAE小鼠的存活率。同時(shí)，鐵死亡相關(guān)的MDA，ROS和LPO也都明顯下降。這些結(jié)果表明ACSL4敲除會(huì)限制鐵死亡的激活，抑制T細(xì)胞的啟動(dòng)和分化，進(jìn)而抑制EAE小鼠的行為缺陷；

3、為了確定鐵死亡信號(hào)通路是否引起T細(xì)胞激活，作者檢測(cè)了用鐵死亡抑制劑Liproxstatin-1（Lip-1）處理的EAE小鼠中T細(xì)胞反應(yīng)。使用Lip-1處理之后明顯改善了EAE小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和降低了CD4 T細(xì)胞的比例。如果只存在較少的激活的浸潤(rùn)T細(xì)胞，注射Lip-1并不能緩解癥狀。這一發(fā)現(xiàn)可能表明Lip-1僅在EAE晚期發(fā)生T細(xì)胞浸潤(rùn)或小鼠發(fā)生肌肉wei縮時(shí)才有效。

4、作者進(jìn)一步驗(yàn)證鐵死亡如何在EAE小鼠中影響T細(xì)胞的功能。作者用鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3處理的原代神經(jīng)元收獲的培養(yǎng)基去培養(yǎng)CD4 T細(xì)胞，結(jié)果表明鐵死亡的神經(jīng)元細(xì)胞上清液會(huì)增加II2和Ifng的表達(dá)，表明鐵死亡會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞的激活。此外，鐵死亡通過(guò)調(diào)節(jié)TCR信號(hào)通路促進(jìn)T細(xì)胞的激活。鐵死亡的神經(jīng)元會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞的激活，加重EAE的進(jìn)展。

5、最后作者使用抑制鐵死亡的Ceruloplasmin (Cp)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)表明，用Cp處理EAE小鼠后，緩解了小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙，同時(shí)也降低了脊髓中鐵離子和LPO的水平。此外，Cp的處理也顯著降低了EAE小鼠的浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞，CD4 T細(xì)胞顯著減少。這些結(jié)果表明了Cp在EAE中潛在的治療作用，并且這種作用依賴于鐵死亡的抑制。

綜上所述，作者通過(guò)一系列研究證明了ACSL4介導(dǎo)的鐵死亡會(huì)誘導(dǎo)炎癥和促進(jìn)CNS浸潤(rùn)和T細(xì)胞激活，進(jìn)而引發(fā)EAE的神經(jīng)炎癥和脫髓鞘的作用，通過(guò)針對(duì)鐵死亡介導(dǎo)的T細(xì)胞激活相關(guān)的治療策略可能是抑制CNS炎癥和治療MS新方向。

使用到的技術(shù)主要有：RNA-seq analysis，Heatmap preparation，sgRNA selection，EAE模型小鼠構(gòu)建，流式，免疫組化，免疫熒光

第五篇
Creatine kinase B suppresses ferroptosis by phosphorylating GPX4 through a moonlighting function

發(fā)表期刊：nature cell biology（IF：21.3）

發(fā)表時(shí)間：2023年5月

谷胱甘肽依賴性脂質(zhì)氫過(guò)氧化物酶4（GPX4）利用谷胱甘肽(GSH)作為輔助因子，將有毒的脂質(zhì)氫過(guò)氧化物(L-OOH)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的脂質(zhì)醇(L-OH)，在抵抗不可逆過(guò)氧化和抑制鐵死亡中發(fā)揮重要作用。抑制GPX4誘導(dǎo)鐵死亡已成為一種觸發(fā)癌細(xì)胞死亡的治療策略。然而，癌細(xì)胞中GPX4穩(wěn)定性調(diào)控的機(jī)制以及這種調(diào)控對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響尚不清楚。本篇文章中浙江大學(xué)的許大千教授團(tuán)隊(duì)揭示了腫瘤細(xì)胞通過(guò) CKB 增強(qiáng) GPX4 穩(wěn)定性的非代謝功能來(lái)對(duì)抗鐵死亡的關(guān)鍵機(jī)制，并強(qiáng)調(diào)了靶向CKB蛋白激酶活性進(jìn)行癌癥治療的潛力。

胰島素樣生長(zhǎng)因子 1 受體信號(hào)激活的 AKT 可使肌酸激酶 B（CKB）T133 磷酸化，降低 CKB 的代謝活性，增加 CKB 與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 4（GPX4）的結(jié)合。重要的是，CKB 可作為蛋白激酶使 GPX4 在S104位點(diǎn)磷酸化。這種磷酸化阻止 HSC70 與 GPX4 的結(jié)合，從而減弱小鼠的鐵死亡并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。此外，在人肝癌細(xì)胞樣本中，GPX4 的水平與 CKB T133 和 GPX4 S104 的磷酸化水平呈正相關(guān)，并與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。
  

1、    首先作者對(duì)GPX4的表達(dá)是否會(huì)被致癌的信號(hào)通路調(diào)節(jié)，作者用IGF1（誘導(dǎo)HCC發(fā)生的信號(hào)）處理Huh7和HCCLM3人肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞。結(jié)果表明IGF1的處理會(huì)增加GPX4的蛋白水平。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明GPX4的表達(dá)受翻譯后調(diào)控。為了確定這種調(diào)控的機(jī)制，作者對(duì) GPX4 免疫沉淀物進(jìn)行了質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示 IGF1 誘導(dǎo)了 GPX4 和 CKB 之間的相互作用。

2、    為了闡明 IGF1 誘導(dǎo) CKB 與 GPX4 結(jié)合的機(jī)制，作者用U0126、SU6656、SP600125和MK-2206預(yù)處理了Huh7細(xì)胞，結(jié)果表明，肉豆蔻?；钚?AKT（myr-AKT）的表達(dá)增加了 CKB 與 GPX4 的結(jié)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IGF1 處理增強(qiáng)了 AKT 與 CKB 的結(jié)合，IGF1 誘導(dǎo)和 AKT 介導(dǎo)的 CKB T133 磷酸化減少了其與肌酸的結(jié)合，降低了CKB的代謝活性，進(jìn)而促進(jìn)了 CKB 與 GPX4 的結(jié)合，增強(qiáng)了 GPX4 的穩(wěn)定性。

3、    通過(guò)關(guān)聯(lián)的定量分析、結(jié)合親和力分析等一些列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IGF1 誘導(dǎo)和 AKT 介導(dǎo)的 CKB T133 磷酸化促進(jìn)了 CKB 與 GPX4 的結(jié)合，隨后 CKB 介導(dǎo)的 GPX4 S104 磷酸化與 CKB 的代謝活性無(wú)關(guān)。為了進(jìn)一步證實(shí) CKB 的蛋白激酶活性與其代謝活性無(wú)關(guān)，作者在內(nèi)源性 CKB 缺失的 HCC 細(xì)胞中表達(dá)了無(wú)活性的 CKB C283S 和 CKB R292H。結(jié)果表明，蛋白激酶活性對(duì) GPX4 的穩(wěn)定性至關(guān)重要，它需要 ATP 結(jié)合能力，而不是 CKB 的代謝活性。CKB 介導(dǎo)的 GPX4 S104 磷酸化穩(wěn)定了 GPX4 的表達(dá)。

4、    鐵死亡的激活增加了溶酶體相關(guān)膜蛋白 2a（LAMP2A）的水平，從而促進(jìn)了 HSC70 合子介導(dǎo)的自噬（CMA）和 CMA 介導(dǎo)的 GPX4 降解。GPX4 與HSC70 有相互作用，在有活性 AKT 存在的情況下，由 CKB 介導(dǎo)的 GPX4 中 S104 的磷酸化會(huì)破壞這種結(jié)合。一系列位點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)表明，IGF1 誘導(dǎo)和 CKB 介導(dǎo)的 GPX4 S104 磷酸化可通過(guò)阻斷 GPX4 與 HSC70 的結(jié)合以及隨后 CMA 介導(dǎo)的 GPX4 降解來(lái)穩(wěn)定 GPX4 的表達(dá)。

5、GPX4 可解毒脂質(zhì)過(guò)氧化物并防止鐵死亡，而 GSTs 和 GRX 可減少非脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)生的細(xì)胞膜和線粒體 ROS。此外，活化的 IGF1R/AKT 誘導(dǎo)和 CKB 介導(dǎo)的 CKB T133A或者GPX4 S104A的磷酸化抑制了鐵死亡反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，CKB 介導(dǎo)的 GPX4 磷酸化促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

綜上所述，本篇文章通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證明了CKB蛋白激酶活性依賴性調(diào)控GPX4和腫瘤細(xì)胞中的鐵死亡以及CKB pT133或GPX4 pS104的水平與HCC病人的短生存期呈正相關(guān)，強(qiáng)調(diào)了CKB蛋白激酶活性用于治療人類癌癥的潛力。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了代謝酶的致癌信號(hào)重編程代謝和非代謝在對(duì)抗鐵死亡中的重要作用。

使用到的技術(shù)主要有：DNA構(gòu)建和突變，體外酶活測(cè)定，質(zhì)譜分析，Crispr-Cas9，重組蛋白純化

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