PeproTech 重組人IFN-γ （Animal Free）

生產(chǎn)商          產(chǎn)品名稱(chēng)                                        產(chǎn)品編號(hào)         產(chǎn)品規(guī)格
PeproTech 重組人Flt-3 Ligand (Animal Free)    AF-300-19 10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重組人IL-7 (Animal Free)      AF-200-07 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重組人IL-15 (Animal Free)    AF-200-15 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech 重組人SCF (Animal Free)       AF-300-07 10ug/50ug/100ug/250ug/500ug/1mg
PeproTech
(BioGems)  人CD28 激發(fā)型單抗 (極低內(nèi)毒素)   (克?。篊D28.2)    10311-25 100ug/500ug

生產(chǎn)商         產(chǎn)品名稱(chēng)                     產(chǎn)品編號(hào)          產(chǎn)品規(guī)格        使用濃度
PeproTech 重組人IFN-γ (Animal Free) AF-300-02 100ug/250ug/500ug/1mg 50ng/ml
PeproTech 重組人IL1-α (Animal Free) AF-200-01A 10ug/100ug/250ug/500ug/1mg 0.1ng/ml
PeproTech 重組人IL-2 (Animal Free) AF-200-02 50ug/100ug/250ug/500ug/1mg 30ng/ml
PeproTech (BioGems)    人CD3 激發(fā)型單抗 (極低內(nèi)毒素)  (克?。篛KT-3)05121-25 100ug/500ug 50ng/ml

注：Animal Free 意為無(wú)動(dòng)物成分。無(wú)動(dòng)物成分的重組細(xì)胞因子在生產(chǎn)過(guò)程中不會(huì)有任何動(dòng)物源性物質(zhì)，尤其是牛蛋白
的混入，使得zui終獲得的重組人蛋白中不含任何動(dòng)物成分。這樣可避免動(dòng)物病原體(如瘋牛病，克雅氏病等)的污染
及外源蛋白引起的機(jī)體異種排斥和過(guò)敏反應(yīng)，因此細(xì)胞治療的體外細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用無(wú)動(dòng)物成分的重組細(xì)胞
因子。

【參考文獻(xiàn)】
[1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer:
a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133

CIK 細(xì)胞的制備方法:

【背景】
CIK 是“Cytokine-Induced Killer Cells"的縮寫(xiě)，中文全稱(chēng)為“細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞"。
CIK 是單個(gè)核細(xì)胞在CD3 單抗和多種細(xì)胞因子(包括IFN-γ, IL-2 等)的作用下培養(yǎng)獲得的一
群以CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群， 其既具有T 淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活
性，又具有NK 細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。
CIK 細(xì)胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對(duì)正常組織毒性低，體外可高度擴(kuò)增等特點(diǎn)，是目前
臨床上廣泛使用的過(guò)繼性免疫-治療細(xì)胞。

【培養(yǎng)原理】
CIK 培養(yǎng)用細(xì)胞因子和抗體：
?? CD3 激發(fā)型單抗：

T 細(xì)胞活化的*信號(hào)來(lái)自于T 細(xì)胞表面的受體，即T 細(xì)胞抗原受體(T cell antigen
receptor, TCR)與APC 提呈的抗原的特異性結(jié)合，也就是T 細(xì)胞對(duì)抗原的特異性識(shí)別。
TCR 是由2 條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，在T 細(xì)胞表面，其與CD3 分子通過(guò)非共價(jià)鍵
結(jié)合，形成TCR/CD3 復(fù)合體。TCR 識(shí)別特異性抗原后會(huì)引起CD3 和T 細(xì)胞表面的輔助
受體CD4 或CD8 分子的胞漿尾部聚集，進(jìn)而激活與胞漿尾部相連的酪-氨酸激酶(Lck, Fyn
和ZAP-70 等)，促使CD3 分子胞漿區(qū)的免疫受體酪-氨酸活化基序(immunoreceptor
tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪-氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪-氨酸(pY)進(jìn)一步
磷酸化下游含酪-氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)(磷脂酰肌醇途徑或MAP 激
酶途徑等)，zui終通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子，使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合于調(diào)控T 細(xì)胞增殖和活
化的靶基因(如IL-2 和IFN-γ等)，引起基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，T 細(xì)胞因而由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)為
增殖和活化狀態(tài)。

由上可見(jiàn)，CD3 分子在T 細(xì)胞活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3 激發(fā)
型單抗與T 細(xì)胞表面CD3 分子特異性結(jié)合后，可引起CD3 分子胞漿區(qū)ITAM 基序中酪
-氨酸的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致T 細(xì)胞增殖和活化的下游信號(hào)的激活，從而使T 細(xì)胞增殖和活
化。也就是說(shuō)，CD3 激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3 復(fù)合物的識(shí)別和激活過(guò)程，
從而引起T 細(xì)胞的增殖與活化，因此是CIK 細(xì)胞培養(yǎng)中*的刺激因素。

此外，CD3 激發(fā)型單抗在選用時(shí)一定要注意克隆號(hào)。研究表明，僅克隆號(hào)為OKT-3
的CD3 激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T 細(xì)胞的增殖，而其它克隆號(hào)的CD3 激發(fā)型單抗
僅能刺激一部分人的T 細(xì)胞。因此，在進(jìn)行CIK 培養(yǎng)時(shí)，選用OKT-3 克隆，以保
證每個(gè)患者的T 細(xì)胞均能被激活。

?? IL-2 (白細(xì)胞介素-2)
IL-2 zui初發(fā)現(xiàn)時(shí)被稱(chēng)為T(mén) 細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T 細(xì)胞
增殖zui重要的細(xì)胞因子。IL-2 既是自分泌細(xì)胞因子，也是旁分泌細(xì)胞因子，其通過(guò)與T

細(xì)胞表面的IL-2 受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T 細(xì)胞活化，并進(jìn)入細(xì)胞分裂狀態(tài)。
此外，IL-2 還可刺激NK 細(xì)胞的生長(zhǎng)并增強(qiáng)其殺傷能力。因此CIK 細(xì)胞培養(yǎng)中須添加
IL-2，以促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖與活化。
?? IFN-γ (干擾素-γ)
IFN-γ 具有上調(diào)外周血淋巴細(xì)胞表面IL-2R表達(dá)的作用，因此會(huì)增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)IL-2促
增殖反應(yīng)的敏感度和強(qiáng)度。在誘導(dǎo)CIK細(xì)胞形成的過(guò)程中加入IFN- γ ，可降低IL-2的用量。
研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ加入的順序與CIK的細(xì)胞毒活性密切相關(guān)。先加入IFN- γ，培養(yǎng)24后再
加入IL-2，可明顯提高CIK的細(xì)胞毒活性。

?? IL-1α(白細(xì)胞介素-1α)
IL-1α也可以介導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)IL-2R。當(dāng)IL-1α與IFN-γ和激發(fā)型
CD3 單抗合用時(shí)，可以明顯提高CIK 的細(xì)胞毒作用。

【細(xì)胞制備】
1． 外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集
1.1 用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞50-100mL；
1.2 淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；
1.3 無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2 次，獲得純度在90%以上的PBMC。

2． CIK 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
2.1 將PBMC 按1-2 x 106/ml 的濃度懸浮于無(wú)血清培養(yǎng)液中，加入1,000 U/ml 的重組
人IFN-γ，37oC，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
2.2 24h 后加入50ng/ml 的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細(xì)
胞的生長(zhǎng)和增殖；
注：此時(shí)也可同時(shí)加入100 U/ml 的重組人IL-1α。
2.3 每3 天半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人IL-2 300 U/ml；
2.4 在培養(yǎng)的第14d，收獲CIK 細(xì)胞。
2.5 CIK 細(xì)胞質(zhì)控：
2.9.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；
2.9.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD3、CD8、CD56 等分子的表達(dá)：CD3+CD56+細(xì)
胞的比例應(yīng)在20%以上。
2.9.3 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：以CIK 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以腫瘤細(xì)胞(可為原代腫瘤細(xì)胞或
腫瘤細(xì)胞株)為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按10 : 1(數(shù)目比) 的比例加入
96 孔U 型板中，每孔含靶細(xì)胞1 x 104 個(gè)，終體積為200 μl，設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。
培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶
細(xì)胞的殺傷率。
2.9.4 收獲細(xì)胞前，取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測(cè)支原體、衣原體，
及內(nèi)毒素(標(biāo)準(zhǔn)：病原學(xué)檢測(cè)陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。