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技術(shù)文章

ULTRARIPA® Kit 應(yīng)用數(shù)據(jù)

閱讀:1054          發(fā)布時(shí)間:2018-11-27

◆評(píng)價(jià)ULTRARIPA® Kit B buffer 單獨(dú)提取脂筏蛋白的能力

(數(shù)據(jù)提供:東京大學(xué) 大學(xué)院藥學(xué)系研究科 衛(wèi)生化學(xué)教室)

 

  用PBS清洗COS-1細(xì)胞后,用SDS buffer、1% Triton X-100 buffer,ULTRARIPA® Kit A buffer以及ULTRARIPA® Kit B buffer溶解,離心(14,000 rpm, 5 min, 4°C)。分離可溶性組分和不溶性組分。不溶性組分用等量的SDS-PAGE sample buffer變性溶解。通過(guò)SDS-PAGE / Western印跡評(píng)價(jià)脂筏標(biāo)記物中Flotilin 1的可溶解量。在普通1%Triton X-100和RIPA緩沖液中,大部分的Flotilin 1保留在不溶性膜組分中,然而在ULTRARIPA® Kit B緩沖液中幾乎全部溶解了。

 

111.jpg

 

各緩沖液的成分:

SDS buffer(2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mM NaCl)

ULTRARIPA® Kit A buffer (1% NP-40 Alternative,0.1% SDS,50 mM Tris-HCl (pH8.0),150 mM

NaCl,0.5% Sodium Deoxycholate)

ULTRARIPA® Kit B buffer (不公開(kāi)成分)
1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mM NaCl)

 

◆用ULTRARIPA® Kit觀察NGF刺激依存的Integrin的脂筏轉(zhuǎn)換

(數(shù)據(jù)提供:國(guó)立精神·神經(jīng)醫(yī)療研究中心 神經(jīng)研究所 疾病研究第五部)

 

      使用的樣本:小鼠來(lái)源原代培養(yǎng)DRG神經(jīng)細(xì)胞(DIV13,~106 cells/35 mm dish)

      目標(biāo)蛋白:Integrinβ1, Flotillin 1

 

步驟:

      1.在存在和不存在50ng/mL NGF的情況下培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞(各準(zhǔn)備2個(gè)樣品)

      2.用PBS清洗COS-1細(xì)胞后,添加150 μL ULTRARIPA® Kit A-buffer,并在冰上孵育

      3.離心分離可溶性組分①和不溶性組分

      4.準(zhǔn)備的2個(gè)A-buffer不溶性組分的樣品,其中一個(gè)管添加150 μL 1× SDS sample buffer使其*溶解②

      5.添加150 μL B-buffer至另一管A-buffer不溶性組分中,懸浮沉淀物

      6.離心并分離B-buffer可溶性組分③和不溶性組分

      7.添加150 μL 1× SDS-PAGE sample buffer至B-buffer不溶性組分中,使其*溶解④

 

結(jié)果:

  與NGF刺激中未看到Flutillin的波動(dòng)相比,觀察到了Integrinβ1通過(guò)NGF濃縮在RIPA不溶性部分中。

 

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◆使用ULTRARIPA® Kit分析神經(jīng)突觸相關(guān)蛋白的可溶性和復(fù)合物

(本數(shù)據(jù)是在Funakoshi與學(xué)習(xí)院大學(xué)理學(xué)部 高島明彥教授,住岡曉夫助教共同研究下取得)

 

■  直接添加B-buffer驗(yàn)證溶解效率

      使用的樣本:小鼠腦組織(海馬體+大腦皮質(zhì))來(lái)源的P2膜組分*

*P2模組分的回收步驟

 

  從小鼠腦組織切除海馬體以及大腦皮質(zhì),添加勻漿緩沖液(10 mM HEPES (pH 7.4), 0.32 M Sucrose, protease inhibitors)并用Dounce型勻漿器破碎。

  低速(×1,000 g)10分鐘離心組織破碎液,去除沉淀的核組分(P1組分)。

  上清(S1)組分用中速(×13,200 g)20分鐘進(jìn)一步離心,去除上清(S2)組分,回收沉淀的膜(P2)。

 

使用緩沖液條件:

      SDS:2% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl

      1% Triton:1% TritonX-100, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl ULTRARIPA® Kit

      A-buffer(RIPA):1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl

      B-buffer:非公開(kāi)

 

步驟:

      1. 添加各緩沖液100 mL至P2組分中,在冰上進(jìn)行超聲處理

      2. 高速(×100,000 g)離心破碎液,沉淀不溶性組分,回收各可溶性組分

      3. 添置100 μL 2% SDS緩沖液至各不溶性組分并使其溶解。

 

結(jié)果:

  在經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的所有神經(jīng)突觸相關(guān)蛋白中,ULTRARIPA® Kit B-buffer的溶解效率比1%Triton X-100和RIPA緩沖液(A-buffer)高。

 

 

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■  驗(yàn)證神經(jīng)細(xì)胞膜來(lái)源RIPA不溶性組分的B-buffer溶解效率

      使用的樣本:小鼠腦組織(海馬體+大腦皮質(zhì))來(lái)源的P2膜組分

 

步驟:

      1. 添加200 μL A-buffer(RIPA)至P2膜組分,在冰上進(jìn)行超聲處理

      2. 高速(×100,000 g)離心破碎液,除去可溶性組分,單獨(dú)分離不溶性組分。

      3. 添加200 mL 2% SDS,A-buffer或B-buffer至A-buffer不溶性組分,在冰上進(jìn)行超聲處理

      4. 離心(×100,000 g)各溶液,并分離可溶性組分和不溶性組分

      5. 為了檢測(cè)B-buffer不溶性組分中殘留的蛋白,添加2% SDS至B-buffer組分中使其*溶解

 

結(jié)果:

      發(fā)現(xiàn)B-buffer能夠溶解神經(jīng)細(xì)胞膜的RIPA不溶性組分中包含的大多數(shù)蛋白。

      此外,還可以高效提取NMDA型谷氨酸受體亞基的GluN1和GluN2B。

      另一方面,盡管PSD 95的可溶性有所提高,但發(fā)現(xiàn)它仍殘留在B-buffer的不溶性組分中。

 

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■  使用ULTRARIPA® Kit分析神經(jīng)突觸蛋白復(fù)合物

      使用的樣本:小鼠腦組織(海馬體+大腦皮質(zhì))來(lái)源的P2膜組分

      目標(biāo):NMDA型谷氨酸受體NMDAR(GluN1/GluN2B)

       AMPA型谷氨酸受體 AMPAR(GluA1/GluA2)

 

步驟:

1. 添加ULTRARIPA® Kit B-buffer至P2膜組分,在冰上進(jìn)行超聲處理;
2. 高速離心(×100,000 g)破碎液,獲取可溶性組分;
3. 

添加1 μg對(duì)照IgG或抗GluN2B抗體或GluA2/3抗體至100 μL可溶性組分,并在4°C下反應(yīng)1小時(shí)后,添

20μL bed vol Protein A磁珠并反應(yīng)1小時(shí);

4. 用PBST(0.05% Tween20 in PBS)清洗磁珠3次;
5. 添加1×SDS-PAGE樣本緩沖液,在100°C加熱條件下洗脫。

 

結(jié)果:

      使用ULTRARIPA® Kit B-buffer,NMDAR,AMPAR都能通過(guò)免疫沉淀特異性的檢測(cè)出復(fù)合物。

 

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*SYN (Synaptophysin)

 

 

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