◆評(píng)價(jià)ULTRARIPA^® Kit B buffer 單獨(dú)提取脂筏蛋白的能力

（數(shù)據(jù)提供：東京大學(xué) 大學(xué)院藥學(xué)系研究科 衛(wèi)生化學(xué)教室）

 

　　用PBS清洗COS-1細(xì)胞后，用SDS buffer、1％ Triton X-100 buffer，ULTRARIPA^® Kit A buffer以及ULTRARIPA^® Kit B buffer溶解，離心（14,000 rpm, 5 min, 4°C）。分離可溶性組分和不溶性組分。不溶性組分用等量的SDS-PAGE sample buffer變性溶解。通過(guò)SDS-PAGE / Western印跡評(píng)價(jià)脂筏標(biāo)記物中Flotilin 1的可溶解量。在普通1％Triton X-100和RIPA緩沖液中，大部分的Flotilin 1保留在不溶性膜組分中，然而在ULTRARIPA^® Kit B緩沖液中幾乎全部溶解了。

 

 

各緩沖液的成分：

●	SDS buffer（2％SDS, 1％ Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mM NaCl）
●	ULTRARIPA® Kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mM Tris-HCl (pH8.0)，150 mM NaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate)
●	ULTRARIPA® Kit B buffer （不公開(kāi)成分）
●	1％ Triton X-100 (1％ Triton X-100, 50 mM HEPES?Na (pH 7.2), 150 mM NaCl）

 

◆用ULTRARIPA^® Kit觀察NGF刺激依存的Integrin的脂筏轉(zhuǎn)換

（數(shù)據(jù)提供：國(guó)立精神·神經(jīng)醫(yī)療研究中心 神經(jīng)研究所 疾病研究第五部）

 

      使用的樣本：小鼠來(lái)源原代培養(yǎng)DRG神經(jīng)細(xì)胞（DIV13，～106 cells/35 mm dish）

      目標(biāo)蛋白：Integrinβ1, Flotillin 1

 

步驟：

      1．在存在和不存在50ng/mL NGF的情況下培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞（各準(zhǔn)備2個(gè)樣品）

      2．用PBS清洗COS-1細(xì)胞后，添加150 μL ULTRARIPA^® Kit A-buffer，并在冰上孵育

      3．離心分離可溶性組分①和不溶性組分

      4．準(zhǔn)備的2個(gè)A-buffer不溶性組分的樣品，其中一個(gè)管添加150 μL 1× SDS sample buffer使其*溶解②

      5．添加150 μL B-buffer至另一管A-buffer不溶性組分中，懸浮沉淀物

      6．離心并分離B-buffer可溶性組分③和不溶性組分

      7．添加150 μL 1× SDS-PAGE sample buffer至B-buffer不溶性組分中，使其*溶解④

 

結(jié)果：

　　與NGF刺激中未看到Flutillin的波動(dòng)相比，觀察到了Integrinβ1通過(guò)NGF濃縮在RIPA不溶性部分中。

 

 

 

 

◆使用ULTRARIPA^® Kit分析神經(jīng)突觸相關(guān)蛋白的可溶性和復(fù)合物

（本數(shù)據(jù)是在Funakoshi與學(xué)習(xí)院大學(xué)理學(xué)部 高島明彥教授，住岡曉夫助教共同研究下取得）

 

■  直接添加B-buffer驗(yàn)證溶解效率

      使用的樣本：小鼠腦組織（海馬體+大腦皮質(zhì)）來(lái)源的P2膜組分*

*P2模組分的回收步驟

 

　　從小鼠腦組織切除海馬體以及大腦皮質(zhì)，添加勻漿緩沖液（10 mM HEPES (pH 7.4), 0.32 M Sucrose, protease inhibitors）并用Dounce型勻漿器破碎。

　　低速（×1,000 g）10分鐘離心組織破碎液，去除沉淀的核組分（P1組分）。

　　上清（S1）組分用中速（×13,200 g）20分鐘進(jìn)一步離心，去除上清（S2）組分，回收沉淀的膜（P2）。

 

使用緩沖液條件：

      SDS：2％ SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl

      1％ Triton：1％ TritonX-100, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl ULTRARIPA^® Kit

      A-buffer(RIPA)：1％ NP-40, 0.5％ deoxycholate, 0.1％ SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl

      B-buffer：非公開(kāi)

 

步驟：

      1． 添加各緩沖液100 mL至P2組分中，在冰上進(jìn)行超聲處理

      2． 高速（×100,000 g）離心破碎液，沉淀不溶性組分，回收各可溶性組分

      3． 添置100 μL 2% SDS緩沖液至各不溶性組分并使其溶解。

 

結(jié)果：

　　在經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的所有神經(jīng)突觸相關(guān)蛋白中，ULTRARIPA^® Kit B-buffer的溶解效率比1％Triton X-100和RIPA緩沖液（A-buffer）高。

 

 

 

 

 

■  驗(yàn)證神經(jīng)細(xì)胞膜來(lái)源RIPA不溶性組分的B-buffer溶解效率

      使用的樣本：小鼠腦組織（海馬體+大腦皮質(zhì)）來(lái)源的P2膜組分

 

步驟：

      1． 添加200 μL A-buffer（RIPA）至P2膜組分，在冰上進(jìn)行超聲處理

      2． 高速（×100,000 g）離心破碎液，除去可溶性組分，單獨(dú)分離不溶性組分。

      3． 添加200 mL 2% SDS，A-buffer或B-buffer至A-buffer不溶性組分，在冰上進(jìn)行超聲處理

      4． 離心（×100,000 g）各溶液，并分離可溶性組分和不溶性組分

      5． 為了檢測(cè)B-buffer不溶性組分中殘留的蛋白，添加2% SDS至B-buffer組分中使其*溶解

 

結(jié)果：

      發(fā)現(xiàn)B-buffer能夠溶解神經(jīng)細(xì)胞膜的RIPA不溶性組分中包含的大多數(shù)蛋白。

      此外，還可以高效提取NMDA型谷氨酸受體亞基的GluN1和GluN2B。

      另一方面，盡管PSD 95的可溶性有所提高，但發(fā)現(xiàn)它仍殘留在B-buffer的不溶性組分中。

 

 

 

■  使用ULTRARIPA^® Kit分析神經(jīng)突觸蛋白復(fù)合物

      使用的樣本：小鼠腦組織（海馬體+大腦皮質(zhì)）來(lái)源的P2膜組分

      目標(biāo)：NMDA型谷氨酸受體NMDAR（GluN1/GluN2B）

       AMPA型谷氨酸受體 AMPAR（GluA1/GluA2）

 

步驟：

1．	添加ULTRARIPA® Kit B-buffer至P2膜組分，在冰上進(jìn)行超聲處理；
2．	高速離心（×100,000 g）破碎液，獲取可溶性組分；
3．	添加1 μg對(duì)照IgG或抗GluN2B抗體或GluA2/3抗體至100 μL可溶性組分，并在4°C下反應(yīng)1小時(shí)后，添 加20μL bed vol Protein A磁珠并反應(yīng)1小時(shí)；
4．	用PBST（0.05% Tween20 in PBS）清洗磁珠3次；
5．	添加1×SDS-PAGE樣本緩沖液，在100°C加熱條件下洗脫。

 

結(jié)果：

      使用ULTRARIPA^® Kit B-buffer，NMDAR，AMPAR都能通過(guò)免疫沉淀特異性的檢測(cè)出復(fù)合物。

 

 

＊SYN (Synaptophysin)

 

 

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