近期，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）授予黑色素瘤mRNA疫苗“突破性療法”的認定，這是全球首個獲此認證的mRNA腫瘤疫苗。國內(nèi)首款新型冠狀病毒mRNA疫苗也于近期納入緊急使用。mRNA疫苗是目前最炙手可熱的醫(yī)藥領(lǐng)域之一，被譽為“全能鑰匙”的mRNA疫苗，理論上能夠表達任何蛋白，在疫苗、腫瘤治療、先天性代謝疾病等領(lǐng)域都有著極為廣闊的前景。但作為一類全新的疫苗，其質(zhì)量控制仍處于探索階段，一起來看看島津最新的應(yīng)用研究成果！

mRNA疫苗作用原理與生產(chǎn)流程

mRNA疫苗是通過將編碼抗原蛋白的mRNA接種至人體，mRNA作為模板合成抗原蛋白，誘導(dǎo)或激活機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而預(yù)防和治療疾病。

mRNA的生產(chǎn)工藝流程主要包括以下五步：質(zhì)粒制備，體外轉(zhuǎn)錄，體外修飾，純化，載體遞送。

mRNA疫苗質(zhì)量控制

根據(jù)mRNA疫苗制備流程，島津結(jié)合自身儀器建立了mRNA疫苗質(zhì)量控制解決方案。

方案優(yōu)勢：

l                      此方案涵蓋了mRNA生產(chǎn)工藝流程中關(guān)鍵質(zhì)量控制，且同一個分析項目提供多種儀器的解決方案，內(nèi)容豐富。

l                      方案中涉及的島津新款儀器在mRNA質(zhì)量控制中表現(xiàn)出優(yōu)異性能，如蒸發(fā)光散射檢測器ELSD-LT III、生物惰性液相色譜儀Nexera XS inert、基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜儀MALDI-8030等儀器。

質(zhì)粒構(gòu)型分析

質(zhì)粒具有3種基本構(gòu)型：超螺旋(Supercoiled，簡稱SC)、線性(Linear)和開環(huán)(Opencircular，簡稱OC)。島津采用生物惰性液相分析3種構(gòu)型質(zhì)粒，實現(xiàn)基線分離，可用于超螺旋質(zhì)粒純度的測定。

圖片生物惰性液相色譜儀實物圖（左）和3種狀態(tài)質(zhì)粒色譜圖（右）

mRNA原料定性分析

mRNA制備過程中非常重要的一步是將DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，其中需要用到的原料有三磷酸核苷（NTPs）。島津通過單四極桿質(zhì)譜(LCMS-2050)確定不同NTPs分子量，從而對原料進行定性分析。LCMS-2050標配DUIS（ESI+APCI）離子源，質(zhì)量范圍廣，兼顧了小型化及高性能。

LCMS-2050實物圖（左）和mRNA合成原料ATP質(zhì)譜圖（右）

mRNA疫苗加帽率分析

帽子結(jié)構(gòu)是mRNA翻譯起始的必要結(jié)構(gòu)，為核糖體識別mRNA提供了信號，協(xié)助核糖體與mRNA結(jié)合，使翻譯從AUG開始。同時帽子結(jié)構(gòu)可增加mRNA的穩(wěn)定性，保護mRNA免遭核酸外切酶的攻擊。所以，加帽率的高低直接影響著mRNA疫苗的藥效及穩(wěn)定性。島津推薦通過MALDI-TOF(MALDI-8030)或QTOF(LCMS-9030 /9050)對加帽率進行檢測，其中MALDI-TOF測定加帽率操作簡便快速，無需優(yōu)化流動相、色譜柱等繁瑣操作。

MALDI-8030實物圖（左）和mRNA樣品加帽后質(zhì)譜圖（右）

mRNA疫苗純度分析

mRNA 純度對于保障 mRNA 疫苗的有效性和安全性至關(guān)重要。由于mRNA中含磷酸基團，在常規(guī)液相系統(tǒng)中容易產(chǎn)生金屬吸附，從而影響分析的靈敏度、精密度等性能。島津生物惰性液相系統(tǒng)中管路經(jīng)peek內(nèi)襯，整個流路無不銹鋼金屬材料，從而抑制金屬吸附，完美實現(xiàn)mRNA純度分析。

生物惰性液相色譜儀實物圖（左）和mRNA純度分析結(jié)果（右）

遞送介質(zhì)分析

為了mRNA免受核酸酶的攻擊，并允許傳遞進入細胞，需要使用遞送系統(tǒng)。目前mRNA疫苗遞送介質(zhì)主要為脂質(zhì)納米粒（LNP），其由四種成分組成，分別是膽固醇，修飾化PEG，可離子化脂質(zhì)和輔助脂質(zhì)。

因LNP組分無紫外和熒光信號，因此推薦使用液相色譜聯(lián)合蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）定量分析LNP四種成分。ELSD-LT III是島津最新一代蒸發(fā)光散射檢測器，具有靈敏度高、線性范圍廣等優(yōu)異特性，在樣品分析時采用wide模式，無需優(yōu)化增益值，可同時快速分析四種不同含量的LNP成分。

ELSD-LT III檢測器實物圖（左）和LNP色譜圖（右）

根據(jù)中國藥典，可采用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)等方法測定LNP成分之一聚乙二醇的重均/數(shù)均分子量及多分散性。利用島津MALDI-8030即可分析PEG分子量。

MALDI-8030實物圖（左）和PEG質(zhì)譜圖（右）

使用島津掃描探針顯微鏡（SPM-9700HT），測定了mRNA疫苗樣品的表面形貌，并使用儀器自帶的軟件一鍵將其轉(zhuǎn)換成了更加清晰、直觀的三維形貌圖。

掃描探針顯微鏡SPM-9700HT實物圖（上）和mRNA表面形貌圖（下）

結(jié)語

mRNA技術(shù)應(yīng)用前景非常廣闊，除了能夠用于預(yù)防傳染性疾病，也為治療腫瘤、免疫疾病帶來了新的星火。但mRNA在序列設(shè)計和遞送系統(tǒng)等環(huán)節(jié)還存在一定的技術(shù)壁壘，眾多mRNA疫苗仍處于研發(fā)和臨床階段，希望島津mRNA質(zhì)量控制解決方案為mRNA疫苗的發(fā)展添磚加瓦。

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