細胞干貨|讓你的細胞狀態(tài)迎接轉(zhuǎn)染

1、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：

陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內(nèi)吞進入細胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前實驗室的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時間一般不超過24小時。常用細胞類型:cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。

優(yōu)點：操作簡單、轉(zhuǎn)染率高、可轉(zhuǎn)染DNA、RNA蛋白質(zhì)。

缺點：有些細胞系不容易轉(zhuǎn)染，需要進行條件優(yōu)化，

2.電穿孔轉(zhuǎn)染法：

電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使DNA分子進入胞內(nèi)，這種方法就是電穿孔。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下，高電場強度會殺死50%-70% 的細胞?，F(xiàn)在針對細胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護劑，可以大大的降低細胞的死亡率，同時提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率。

優(yōu)點：原理簡單、不需要載體、不限制細胞類型和條件，

缺點：需要特殊的設(shè)備，對細胞傷害很大，細胞死亡率高。

3、病毒感染：

對于脂質(zhì)轉(zhuǎn)染于電穿孔轉(zhuǎn)染都無法成功轉(zhuǎn)染的細胞建議用病毒感染，此法可以快速100%感染，檢測成功率高。

優(yōu)點：高轉(zhuǎn)染效率，適用于較難轉(zhuǎn)染的細胞系，可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染。

缺點：技術(shù)難度高，構(gòu)建重組蛋白是費時，存在生物安全問題，基因插入大小受限。

4、磷酸鈣共沉淀法：

該方法可重復(fù)性差，而且磷酸鈣溶液對溫度，PH和緩沖鹽濃度的變化十分敏感，對細胞尤其是原代細胞毒性較大，也不能采用RPMI培養(yǎng)基，因為其含有高濃度的磷酸鹽。

優(yōu)點：便宜且容易獲得，轉(zhuǎn)染效率高，適用于生產(chǎn)是和穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

缺點：可重復(fù)性較差，不適用于動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染，有細胞毒性，尤其對原代細胞

組織培養(yǎng)試劑：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基—目前所使用的各種市售培養(yǎng)基(如，RPMI 1640和DMEM)。培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸，葡萄糖)，維生素，無機鹽，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果不在使用時新鮮加入就可能會產(chǎn)生問題。務(wù)必要使培養(yǎng)基避光保存。因為已知有一些組分和緩沖物質(zhì)，如HEPES，當(dāng)暴露于光照下就會分解產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)。另外，血清，添加劑，來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì)，或真菌/細胞的污染也都可能影響到細胞生理。

細胞生長狀態(tài)：

密切觀察細胞，確保它們狀態(tài)良好，貼壁細胞相比較懸浮細胞—在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細胞和懸浮細胞之間的差異顯著，天生趨于懸浮的細胞非常難以轉(zhuǎn)染，相反，天生為貼壁的細胞則可適應(yīng)懸浮生長的條件，

載體DNA：

載體的完整性是載體是否具有功能取決于他結(jié)構(gòu)的完整性，轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比列、涮螺旋終端、核酸酶的降解，以及來自于儲存和處理過程中的物理壓力的影響。