怎么避免實(shí)驗(yàn)遭受抗體災(zāi)難？抗體選擇指南送給你？

抗體問題一直困擾著廣大科研工作者，抗體市場(chǎng)魚龍混雜，雖然是一個(gè)名字但是每個(gè)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量都是不同的，今天給大家分享一些抗體選擇的經(jīng)驗(yàn)~ 檢測(cè)任何目的靶蛋白都不止一種抗體可供選擇，為縮小抗體的選擇范圍選中合適的抗體，需要考慮如下幾種因素：

1、分析或應(yīng)用的類型

一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過適用于何種分析類型，如：可以應(yīng)用于 WB IHC ICC ELASA 分析等，如果抗體說明書沒有提及的應(yīng)用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而僅是說明尚未經(jīng)過此種分析試驗(yàn)驗(yàn)證，如果抗體不適用某些分析試驗(yàn)，則會(huì)在抗體說明書上標(biāo)注出來不適于某分析試驗(yàn)。

2、樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于挑選最適宜的抗體，至少兩方面要素需求考慮待測(cè)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其間的免疫原包含：全長(zhǎng)蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體或細(xì)胞，抗體闡明書一般都有免疫原的描述，假如計(jì)劃?rùn)z測(cè)的是蛋白片斷或一種特別的同型物或蛋白全長(zhǎng)的某一區(qū)域，則有必要挑選用含此片段域的免疫原制備出的抗體。假如計(jì)劃用 FACS 流式檢測(cè)活細(xì)胞的外表蛋白，則需求挑選含該外表蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。

樣本的提取或處理過程：某些抗體要求樣本經(jīng)過某些特別處理，例如：許多抗體只辨認(rèn)復(fù)原和變性的、表位已暴露不受二級(jí)四級(jí)結(jié)構(gòu)阻止的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅辨認(rèn)天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)挑選免疫組化的抗體時(shí)，應(yīng)留意某些抗體只辨認(rèn)未固定的冷凍的安排，而另一些抗體則適用于無需抗原修正的甲醛固定石蠟包埋的安排，這些都會(huì)在抗體闡明書上運(yùn)用部分標(biāo)明出來。

3、樣本的物種

應(yīng)挑選物種相同或有交叉反響的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反響，因其氨基酸序列同源性較高，假如樣本的品種未列入抗體闡明書上的交叉反響種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測(cè)該物種的蛋白，而只是表示該物種沒有用此抗體檢測(cè)驗(yàn)證過，應(yīng)通過序列比對(duì)的辦法來預(yù)測(cè)交叉反響，可運(yùn)用 Expasy 和 NCBI BLAST 來進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對(duì)。

4、抗體宿主的品種

一抗的挑選：
一般說來，在運(yùn)用偶聯(lián)二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時(shí)，一抗宿主動(dòng)物的物種挑選較為重要，對(duì)于免疫組化而言，盡可能挑選與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反響，例如：檢測(cè)小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)挑選小鼠或大鼠源的一抗，選兔源的一抗，則二抗則可挑選偶聯(lián)了檢測(cè)分子的抗兔 IgG。

假如挑選有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對(duì)不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測(cè)辦法，則抗體宿主物種的影響不大，如對(duì)不含 IgG 的細(xì)胞裂解物樣本的 western blotting 檢測(cè)，盡管如此，含有血清的安排裂解物和安排培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，復(fù)原變性樣本中含IgG，在western blot 檢測(cè)中則結(jié)合呈現(xiàn) IgG 分子50 and 25 kDa 的重鏈和輕鏈條帶。

二抗的挑選：
二抗應(yīng)選用與運(yùn)用的一抗相同的物種來源，例如：假如你的一抗是小鼠的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗 anti-mouse secondary 。建議檢查二抗闡明書保證該抗體適用于你的檢測(cè)運(yùn)用， 二抗一般連接熒光素 FITC 或發(fā)光團(tuán)。

兩層染色抗體的挑選：
兩層染色抗體的挑選用未偶聯(lián)一抗進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)物或安排切片的兩層免疫染色要求一抗來源于不同物種而且二抗分別辨認(rèn)其間之一，二抗闡明書應(yīng)描述其與其它物種來源的免疫球蛋有否有交叉吸附。

5、熒光和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記

連接于二抗的標(biāo)記物是為了檢測(cè)抗體的結(jié)合，選擇標(biāo)記物依賴于幾個(gè)參數(shù)：檢測(cè)方法：熒光或著色沉淀，熒光標(biāo)記物用特殊波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)發(fā)射出可見光，下表列出了幾種熒光素的分子特征：

挑選抗體的方法小編已經(jīng)告訴大家了，不可錯(cuò)過哦~