目錄:和元李記(上海)生物技術有限公司>>細胞生物學>>細胞增殖與毒性>> AC11L262EdU細胞增殖流式檢測試劑盒
供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 化工,生物產業(yè),綜合 |
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產品描述
細胞增殖是評價細胞活性、代謝、生理和病理狀況的重要指標。EdU (5-Ethynyl-2`- deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物,其連有的炔烴基團在天然化合物中很少見,能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)摻入正在復制的DNA分子中,通過基于EdU與熒光染料的特異性共軛反應,把熒光基團標記到新合成的含有EdU的DNA上面,這樣可以進行高效快速的檢測出DNA復制活性,此技術廣泛應用于細胞增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA損傷修復等方面的研究。
傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法需要DNA變性、抗原修復、抗原抗體過夜孵育等復雜繁瑣的操作步驟。而EdU檢測方法不需要劇烈的DNA變性,只需溫和的細胞固定化和透化處理,能夠較好地保護細胞形態(tài)、DNA整體結構及細胞內抗原識別位點,操作步驟更加快速、靈敏和準確。EdU與胸腺嘧啶(T)結構非常相似,大小卻只有BrdU抗體的1/500,很容易在細胞內擴散;無需抗原抗體反應,能在細胞和組織水平更快速便捷地反映DNA復制活性。
訂購信息
產品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格 |
EdU細胞增殖流式檢測試劑盒 | AC11L262 | 20 T | 1280 |
產品組分
產品組分 | 規(guī)格 |
EdU溶液 | 80 μL |
反應緩沖液 | 2 mL |
催化劑溶液 | 800 μL |
TAMRA 紅色熒光溶液 | 50 μL |
緩沖添加劑 | 400 mg |
Hoechst 33342 | 40 μL |
運輸與保存
常溫運輸。4℃保存,有效期12個月。
使用方法
細胞培養(yǎng)
將細胞接種于孔板中(以下溶液加入量是以6孔板為例),培養(yǎng)至正常生長階段。
藥物處理
根據實驗需要進行各種細胞處理。
EdU標記
1.設置1個不加EdU標記培養(yǎng)基的NC對照組,以便進行流式檢測數據的背景分析。
2.將細胞培養(yǎng)基與EdU溶液按照500:1的比例混合,制成2×EdU標記培養(yǎng)基。
3.提前將2×EdU標記培養(yǎng)基預熱,然后將500微升2×EdU標記培養(yǎng)基與等體積細胞培養(yǎng)基混合,獲得6孔板中每孔1ml 1×EdU溶液。
【注】:①不建議替換全部培養(yǎng)基,這樣可能會影響細胞增殖的速度;②配置好的培養(yǎng)基建議現用現配,用量以沒過細胞為宜。
4.孵育細胞2 h,棄培養(yǎng)基。
【注】:①培養(yǎng)時間取決于細胞的增殖速度和生長狀態(tài);②大多數腫瘤細胞以及粘附細胞系均可采用2 h的孵育時間。
5.將細胞收集至流式管中,1000rpm 離心5 min,用槍頭吸棄上清。
【注】:①如貼壁細胞,請先消化收集;②離心轉速可按特定細胞培養(yǎng)經驗進行設置。
6.以1×PBS清洗細胞,1000rpm 離心5 min,用槍頭吸棄上清。
細胞的固定和通透
1.每管加入1mL 4%多聚甲醛細胞固定液固定15-30 min,1000rpm 離心5 min,棄固定液。
2.每管加入2mL 2mg/mL 甘xx,搖床孵育5 min,以中和過量的多聚甲醛。
3.1000rpm 離心5 min,棄甘xx溶液,每管加入2mL PBS洗液清洗,1000rpm 離心5 min,棄上清。
4.每管加入1mL 0.5% Triton X-100細胞通透液,室溫通透10 min,1000rpm 離心5 min,棄細胞通透溶液。
5.每管加入2mL PBS洗液,室溫清洗5 min,1000rpm 離心5 min,吸棄上清。
EDU染色
1.通過用10:1去離子水稀釋反應緩沖液,進行配制1×反應緩沖液。
2.按照溶解 200 mg緩沖添加劑溶于1 mL去離子水的比例稱取適量的粉末進行溶解,即為可用的緩沖添加劑的濃度,建議現用現配。
【注】:緩沖添加劑為白色粉末,較難準確稱量,稱量范圍可稍微放寬,但是不應超過±20%,且該粉末較易氧化,使用后請旋緊管蓋,如試劑出現棕黃色,則需報廢或更換。
3.按照以下的表格進行染色反應液的配制:
染色反應液組分 | 500 μL | 1 mL | 2 mL | 5 mL |
1X反應緩沖液 | 430 μL | 860 μL | 1.8 mL | 4.3 mL |
催化劑溶液 | 20 μL | 40μL | 80 μL | 200 μL |
TAMRA紅色熒光溶液 | 1.2 μL | 2.5 μL | 5 μL | 12.5 μL |
緩沖添加劑 | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 500 μL |
4.每管加入配置好的檢測混合液,體積以覆蓋細胞為宜,充分重懸細胞,避光、室溫孵育10-30 min。
5.1000rpm 離心5 min,吸棄染色反應液,每管加入2mL 0.5% Triton X-100細胞滲透液清洗2次,每次10 min;離心棄細胞滲透液,用500uL PBS重懸細胞。
DNA染色
1.將Hoechst 33342 *超級純*(李記貨號:AC12L021)用PBS溶液1:1000進行稀釋得到1×Hoechst染色液。
2.每管加入1×Hoechst染色液,以覆蓋細胞為宜,室溫避光孵育10-15 min后,棄染色液。
3.加入500 μL PBS重懸細胞。
其它染色(自備)
(可選)可以根據實驗需要進行細胞表面或細胞內抗原的抗體染色。染色完的樣品上機檢測時,根據使用的染料選擇合適的通道檢測。
流式檢測及分析
1.建議染色完成后立即進行流式檢測;如果條件限制,請于4℃條件下避光濕潤保存3 d之內完成檢測。
2.檢測細胞數量建議盡量能達到107級,若細胞數量較少,檢測的細胞數量可調整為106起始進行實驗。
熒光染料 | 最大激發(fā)波長 | 最大發(fā)射波長 | 熒光顏色 |
TAMRA | 541 nm | 567 nm | 橘紅色熒光 |
Hoechst 33342 | 350 nm | 461 nm | 藍色熒光 |
注意事項
本產品僅限于科學實驗研究使用,不得用于臨床診斷、治療等領域。