線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）紫外分光光度法

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商品介紹：
MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH，細菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細胞中，NAD-MDH分布于細胞質(zhì)和線粒體中。

測定原理：

MDHm催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致340nm處光吸收下降。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。
測定操作表：

劑組成和配制：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
酶活性計算公式：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量為一個酶活力單位（U）。
DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 18×A460÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。
DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 18×A460÷W
（3）按細胞數(shù)量計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。
DAO活性（nmol/min/104cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數(shù)量）÷T= 18×A460÷細胞數(shù)量
(4) 按液體體積計算
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。
DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 18×A460
ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù)：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應時間，30min
b. 用96孔板測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量為一個酶活力單位（U）。
DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 36×A460÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。
DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 36×A460÷W
（3）按細胞數(shù)量計算：
酶活性定義：在pH7.2，溫度為37℃條件下，每104個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol H2O2所需的酶量定義為一個酶活力單位。
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