線粒體活性氧產(chǎn)生速率（ROS）熒光法測(cè)試盒

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商品介紹：
活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、過(guò)氧化氫、及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物等，研究表明，機(jī)體95％以上的活性氧（ROS）都來(lái)自于線粒體，其失衡所致的氧化應(yīng)激與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程有關(guān)。

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與氧自由基處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平維持在較低的生理范圍；在病理情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧自由基的平衡被打破，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平過(guò)多，就可破壞線粒體酶類(lèi)、脂類(lèi)和核酸，使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，同時(shí)，活性氧還可攻擊線粒體DNA產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致線粒體ATP合成減少、線粒體膜電位破壞等結(jié)構(gòu)和功能變化。

因此，通過(guò)檢測(cè)活性氧的變化來(lái)判斷線粒體的功能是否正常具有重要意義。

測(cè)定原理：

熒光探針-還原型二氯熒光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可擴(kuò)散通過(guò)線粒體膜，在線粒體內(nèi)被酯酶水解，形成無(wú)熒光的DCFH，DCFH迅速與ROS反應(yīng)生成熒光物—氧化型二氯熒光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF)。 根據(jù)上述原理設(shè)計(jì)了利用熒光法直接定量檢測(cè)線粒體ROS產(chǎn)生速率的方法。將熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合，線性回歸直線斜率與ROS產(chǎn)生的速率呈正比。

需自備的儀器和用品：

多功能酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水。

產(chǎn)品名稱(chēng)：線粒體活性氧產(chǎn)生速率（ROS）熒光法測(cè)試盒
規(guī)格 : 100管/96樣
測(cè)試方法: 熒光法
貨號(hào)：GOY-01S6411
分類(lèi)：氧化與抗氧化系列

試劑的組成和配制
提取液一：液體50mL×1瓶，4℃保存。
提取液二：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入40mL試劑四充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；
試劑二：液體18μL×1瓶，4℃保存；臨用前加入2.5mL蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入2.5mL蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；
試劑四：液體50mL×1瓶， 4℃保存；
測(cè)定步驟
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑一、二、三37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘。
3、 加樣表：

樣本的前處理
①總FBP酶提?。航ㄗh稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定。
②胞漿和葉綠體FBP酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測(cè)定胞漿FBP酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測(cè)定葉綠體中FBP酶活性。
建議測(cè)定總FBP酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的FBP，則按照步驟②提取粗酶液。
FBP活性計(jì)算：
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
FBP（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W
V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
【友情提示】：本產(chǎn)品僅供科研研究使用，不得用于人體臨床直接檢測(cè)。避免給您帶來(lái)不必要的損失，請(qǐng)仔細(xì)閱讀購(gòu)買(mǎi)說(shuō)明！
非變性蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)25mg  Hydroxystilbamidine 10mg

蛋白質(zhì)電泳分子量標(biāo)準(zhǔn) (3.3-20.1KD)15 次  HRP 標(biāo)記的兔抗 GST 標(biāo)簽多抗20μL

蛋白質(zhì)電泳分子量標(biāo)準(zhǔn) (14.4-97.4KD)20 次  HRP 標(biāo)記的抗抗體10μL

蛋白質(zhì)電泳分子量標(biāo)準(zhǔn) (43.0-200.0KD)10 次  His 標(biāo)簽蛋白專(zhuān)用蛋白酶抑制劑10mL

預(yù)染蛋白質(zhì)電泳分子量標(biāo)準(zhǔn) (14.4-97.4KD)10 次  Hemoglobin(NO 清除劑 )1g

Forskolin( 腺苷酸環(huán)化酶激活劑 )1mg  Catalase( 抗氧化酶 )200mg

Genistein( 蛋白激酶抑制劑 )25mg  Carboxy-PTIO( 清除劑 )5mg

Glucosamine( 胰島素抵抗誘導(dǎo)劑 )5g  Carboxy-PTIO( 清除劑 )50mg

GSH( 抗氧化劑 )1g  Canavanine，sulfate(iNOS 抑制劑 )100mg

H-89.2HCL(PKA 抑制劑 )5mg  Camptothecin( 喜樹(shù)堿 )100μL
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石蠟包埋組織蛋白提取試劑盒50 次  SDS-PAGE 上樣液，5×10mL

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植物總蛋白質(zhì)微量提取試劑 (2DE) 30 次  SDS-PAGE 電泳液 ( 干粉 )5L