描述：

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲an酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡最早期，膜磷脂酰絲an酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，這一變化早于細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA片斷化和細(xì)胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲an酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲an酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料, 它不能透過完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加，PI 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。

操作步驟：

貼壁細(xì)胞需用 0.25%的yi酶消化。注意過度消化可損傷細(xì)胞。在消化時可加 2％的BSA可防止消化過度。如果用含EDTA的yi酶消化時，注意必須清除EDTA：在標(biāo)記前用 1×PBS或 1×binding buffer洗滌，清除EDTA，以免殘余的EDTA與Ca2+螯合，影響Annexin V的結(jié)合。
（1） 用去離子水將 10×Binding Buffer 稀釋成 1×Binding Buffer；
（2） 細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞收集：離心 5 分鐘；貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的yi酶消化收集后（ 注：yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細(xì)胞膜上磷脂酰絲an酸與Annexin V-FITC 的結(jié)合），在室溫中，2000rpm 離心 5～10 分鐘，收集細(xì)胞；
（3） 細(xì)胞洗滌：用預(yù)冷 1×PBS（4℃）重懸細(xì)胞一次，2000rpm 離心 5～10分鐘，棄上清洗滌細(xì)胞；
（4） 加入 300μL 的 1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；
（5） Annexin V-FITC 標(biāo)記：加入 5μL 的 Annexin V-FITC 混勻后，避光，室溫孵育 15 分鐘；
（6） PI 標(biāo)記：上機(jī)前 5 分鐘再加入 5μL 的 PI 染色。
（7） 上機(jī)前，補(bǔ)加 200μL 的 1×Binding Buffer。
注意：每個反應(yīng)體系建議細(xì)胞數(shù)為1×104至1×106個

操作說明：

（1） 使用前低速離心，以免液體積存管蓋和管壁；
（2） 本試劑只適用于實(shí)驗，不適用于臨床檢測；
（3） PI（propidium iodide，溴化丙錠）有毒性，能通過皮膚吸收，對眼睛有刺激作用，使用時需戴手套；
（4） Annexin V-FITC 和 PI 是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光。在處理和標(biāo)記時，盡可能在暗處進(jìn)行。在孵育階段，用鋁箔包裹容器或置于抽屜中。細(xì)胞標(biāo)記后，在暗室內(nèi)用顯微鏡觀察；
（5） 整個操作過程動作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞，盡量在 4℃下操作，以免影響細(xì)胞狀態(tài)。
（6） 在細(xì)胞洗滌的最后一步，請盡量將上清棄凈，以免 PBS 殘留，有可能會影響實(shí)驗結(jié)果。
（7） 為防止熒光衰變，宜在 1 小時內(nèi)進(jìn)行流式檢測。
（8） PI 染色時間過長有可能造成檢測的凋亡率偏高，建議首先進(jìn)行Annexin V-FITC 染色，最短可在上機(jī)前 5 分鐘再加入 PI 染色。