美谷分子儀器(上海)有限公司

Molecular Devices測定癌細胞球培養(yǎng)物形態(tài)學特征的共聚焦成像及3D圖像分析

時間:2017-5-15 閱讀:1125
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前言:

如今,越來越多的研究者將興趣投入到利用三維(3D)類器官培養(yǎng)物作為組織生物學和癌癥 模型。發(fā)展可對3D模型表型變化做定量分析的高通量檢測技術是當前研究的熱門。研究的目 的是為了發(fā)展高通量的高內涵成像和分析方法,這種方法可用于檢測和分析人類癌細胞球經化 合物處理后的形態(tài)學特征的改變。我們優(yōu)化了針對三種普通癌細胞系使用低附著U型底多孔板 或固體培養(yǎng)基的細胞球培養(yǎng)方案,并改進了工作流程,開發(fā)出一步染色法,減少了可變性。我 們利用共聚焦成像方式采集3D基質和物體的多層切片圖像,有效實現不同細胞球表型之間的 比較。2D和3D圖像分析方法用于提供單細胞和細胞球表型的多參數特征描述。我們報導了一 些結果數據,包括對數量、大小、形狀和類器官的特征描述,總的或者特異性標記的細胞數量, 還有細胞活力和凋亡的測定。我們得到一系列已被證實的抗癌藥物和細胞毒性藥物處理后的不 同讀數及IC50值以闡明濃度應答效應。我們所推薦的方法可以提高使用3D細胞模型進行化合物 篩選和抗癌藥物評價的高內涵檢測手段的表現及通量。

 

目的:

研究目的是優(yōu)化工作流程、開發(fā)新的成像和分析方法,通過對人類3D模型的多個表 性評估來篩選化合物。 

 

材料與方法:

  • ImageXpress®MicroConfocal 高內涵成像系統(tǒng)

  • 帶寬場和共聚焦(60μm針孔)光路• MetaXpress® 6 高內涵成像軟件 

 

試驗開發(fā):

  • 細胞- HCT116人類結腸癌,DU145人類前列腺癌或HepG2肝癌(ATCC)

  • 微孔板– 96或384孔Corning U-型黑色底透板(Corning 4520和3830)
    Hoechst 33342, Calcein AM, Ethidium Homodimer-1, CellEvent-Caspase 3/7, 

  • MitoTracker Orange CMTMRos (Life Technologies/Thermo Fisher)

     

     

 

細胞球形成

我們使用2種不同的檢測格式:
1. 在低附著力U型黑色底透板中(1000細胞/孔),形成每孔只有單個細胞球。使用這些孔板去除 了轉移細胞球的步驟并且可使它們形成于孔的中心位置,有利于10x或20x下對整個細胞球進行 成像。
2. 多個細胞球生長于固態(tài)培養(yǎng)基中(無GFMatrigel基質)。400個細胞接種于1⁄2孔96孔板中。 

 

 

染色:

一步法染料混合物的添加可避免細胞固定及反復洗滌的過程。Calcein AM用來測定具有代 謝活性的細胞、細胞活力和各種形態(tài)學參數。Hoechst用來測定總細胞數和細胞核形狀。EthD-1 選擇性的進入外層細胞膜損傷的細胞以測定死亡和壞死的細胞。染料濃度:Hoechst 15μM, EthD-1 3μM和calcein AM 1μM。Hoechst, calcein AM和EthD-1圖像分別選擇DAPI, FITC和Texas Red 通道采集。另一方案是4%多聚甲醛固定細胞,0.02%皂素提高細胞膜通透性,Hoechst和鬼筆環(huán) 肽連接的AF488進行染色。 

 

結果:使用2D投影的表型分析

成像:

用一個固定補償值獲取僅僅一張圖像并不足以比較不同大小或形狀的細胞球,所以采集多個焦平面上的 圖像是很有必要的。成像方案中采用Hoechst染料對細胞球進行染色。沿聚焦軸(Z-stack)在不同的焦平面上采 集一系列圖像并合成經典的目前較大投影圖像。 


多參數獲取和IC50值

更高分辨率的細胞球成像可以更準確的對單個細胞計數和分類。我們計算圖像中的細胞總數,calcein AM 陽性細胞數,EthD-1陰性細胞(活細胞)數和EthD-1陽性細胞(死細胞)數,也包含不同標記細胞的平均面積和熒 光強度。MetaXpress用戶自定義模塊可進行多參數圖像分析,量化不同的生物學結果。使用代表一批不同等 級抗癌藥物的化合物來描述細胞球測定的表現。 

圖 1. 代表各種表型的細胞球目前較大投影圖像。圖像分析數據為細胞核計數和細胞分類結果:柱狀圖:對照(0.1%DMSO), 紫杉醇150nM,依托泊苷200μM,十字孢堿300nM,絲裂霉素C1μM,阿霉素1μM和氟腺嘌呤100μM。幾何學或平均強 度值依據DMSO對照進行標準化(設為1000)。已選化合物的濃度依賴作用和4參數曲線擬合。紅色-紫杉醇,深紅-十字孢 堿,藍色-阿霉素,綠色-絲裂霉素C,青色-依托泊苷和紫色-氟腺嘌呤。 

 

 

固態(tài)培養(yǎng)基多細胞球分析:

采用相同方式進行半固體培養(yǎng)基中細胞球成像及分析。選擇共聚焦方式采集圖像,沿Z軸間隔5-10um拍 攝各層面圖像,再做目前較大投影分析。用戶自定義模塊可進行單細胞球計數和特征分析,同時也可計算細胞球 中活細胞和死細胞數?;衔锾幚韺е驴寺〉臄盗亢痛笮〗档?,也減少了活細胞數和細胞總數。 

圖 2.Matrigel中Hoechst和鬼筆環(huán)肽-AF488染色的細胞球目前較大投影圖像。由用戶自定義模塊產生的細胞分類結果的圖像分 析數據獲取。已選化合物的濃度依賴作用及4參數曲線擬合。紅色-依托泊苷,綠色-紫杉醇,藍色-十字孢堿,紫色-絲裂 霉素C。 

細胞球物體3D特征分析:

3D分析可應用于不同Z平面物體的,也可應用于細胞球或其他物體的3D特征和形態(tài)學分析。細 胞球物體分析要求計算所有物體的數量:細胞球或單個細胞,也包括細胞球中的細胞數。多參數圖 像分析用來量化不同生物學數據。 

圖 3.Hoechst和鬼筆環(huán)肽-AF488染色的Matrigel中單個細胞球Z平面。注意不同的焦面有不同的物體。 

 

圖 4.Matrigel基質中細胞球計數和Hoechst染色的單個細胞核計數。帶有細胞球物體分析功能的用戶自定義模塊 所獲取的圖像分析結果。已選化合物的濃度依賴作用及4參數曲線擬合。紅色-阿糖胞苷,綠色-順鉑,藍色-氟腺 嘌呤,紫色-阿霉素。 

總結:

我們已經開發(fā)出利用共聚焦系統(tǒng)和高內涵成像的高通量定量檢測方法,這一方法可以評價3D癌細胞模型的活力及形態(tài)學改變。 

高分辨率和多參數分析利用單細胞計數和分類對各種細胞球表型和藥物作用進行統(tǒng)計學特征描述。 

2D和3D分析可對細胞球和單個細胞做特征描述并提供量化的檢測數據,這些數據可用于計算IC50s和各種化合物效力的比較。這一方法的有效性也已通過在384孔板格式下對一組抗癌藥物的篩選所證明。 

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