前言：

如今，越來越多的研究者將興趣投入到利用三維(3D)類器官培養(yǎng)物作為組織生物學(xué)和癌癥 模型。發(fā)展可對(duì)3D模型表型變化做定量分析的高通量檢測(cè)技術(shù)是當(dāng)前研究的熱門。研究的目 的是為了發(fā)展高通量的高內(nèi)涵成像和分析方法，這種方法可用于檢測(cè)和分析人類癌細(xì)胞球經(jīng)化 合物處理后的形態(tài)學(xué)特征的改變。我們優(yōu)化了針對(duì)三種普通癌細(xì)胞系使用低附著U型底多孔板 或固體培養(yǎng)基的細(xì)胞球培養(yǎng)方案，并改進(jìn)了工作流程，開發(fā)出一步染色法，減少了可變性。我 們利用共聚焦成像方式采集3D基質(zhì)和物體的多層切片圖像，有效實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞球表型之間的 比較。2D和3D圖像分析方法用于提供單細(xì)胞和細(xì)胞球表型的多參數(shù)特征描述。我們報(bào)導(dǎo)了一 些結(jié)果數(shù)據(jù)，包括對(duì)數(shù)量、大小、形狀和類器官的特征描述，總的或者特異性標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量， 還有細(xì)胞活力和凋亡的測(cè)定。我們得到一系列已被證實(shí)的抗癌藥物和細(xì)胞毒性藥物處理后的不 同讀數(shù)及IC50值以闡明濃度應(yīng)答效應(yīng)。我們所推薦的方法可以提高使用3D細(xì)胞模型進(jìn)行化合物 篩選和抗癌藥物評(píng)價(jià)的高內(nèi)涵檢測(cè)手段的表現(xiàn)及通量。

目的：

研究目的是優(yōu)化工作流程、開發(fā)新的成像和分析方法，通過對(duì)人類3D模型的多個(gè)表 性評(píng)估來篩選化合物。 

材料與方法：

• ImageXpress®MicroConfocal 高內(nèi)涵成像系統(tǒng)

• 帶寬場(chǎng)和共聚焦(60μm針孔)光路• MetaXpress® 6 高內(nèi)涵成像軟件 

試驗(yàn)開發(fā)：

• 細(xì)胞- HCT116人類結(jié)腸癌，DU145人類前列腺癌或HepG2肝癌(ATCC)

• 微孔板– 96或384孔Corning U-型黑色底透板(Corning 4520和3830)
  Hoechst 33342, Calcein AM, Ethidium Homodimer-1, CellEvent-Caspase 3/7, 

• MitoTracker Orange CMTMRos (Life Technologies/Thermo Fisher)

   

   

細(xì)胞球形成：

我們使用2種不同的檢測(cè)格式:
1. 在低附著力U型黑色底透板中(1000細(xì)胞/孔)，形成每孔只有單個(gè)細(xì)胞球。使用這些孔板去除 了轉(zhuǎn)移細(xì)胞球的步驟并且可使它們形成于孔的中心位置，有利于10x或20x下對(duì)整個(gè)細(xì)胞球進(jìn)行 成像。
2. 多個(gè)細(xì)胞球生長(zhǎng)于固態(tài)培養(yǎng)基中(無GFMatrigel基質(zhì))。400個(gè)細(xì)胞接種于1⁄2孔96孔板中。 

染色：

一步法染料混合物的添加可避免細(xì)胞固定及反復(fù)洗滌的過程。Calcein AM用來測(cè)定具有代 謝活性的細(xì)胞、細(xì)胞活力和各種形態(tài)學(xué)參數(shù)。Hoechst用來測(cè)定總細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞核形狀。EthD-1 選擇性的進(jìn)入外層細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞以測(cè)定死亡和壞死的細(xì)胞。染料濃度:Hoechst 15μM, EthD-1 3μM和calcein AM 1μM。Hoechst, calcein AM和EthD-1圖像分別選擇DAPI, FITC和Texas Red 通道采集。另一方案是4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.02%皂素提高細(xì)胞膜通透性，Hoechst和鬼筆環(huán) 肽連接的AF488進(jìn)行染色。 

結(jié)果：使用2D投影的表型分析

成像：

用一個(gè)固定補(bǔ)償值獲取僅僅一張圖像并不足以比較不同大小或形狀的細(xì)胞球，所以采集多個(gè)焦平面上的 圖像是很有必要的。成像方案中采用Hoechst染料對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行染色。沿聚焦軸(Z-stack)在不同的焦平面上采 集一系列圖像并合成經(jīng)典的目前較大投影圖像。 

多參數(shù)獲取和IC50值：

更高分辨率的細(xì)胞球成像可以更準(zhǔn)確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類。我們計(jì)算圖像中的細(xì)胞總數(shù)，calcein AM 陽性細(xì)胞數(shù)，EthD-1陰性細(xì)胞(活細(xì)胞)數(shù)和EthD-1陽性細(xì)胞(死細(xì)胞)數(shù)，也包含不同標(biāo)記細(xì)胞的平均面積和熒 光強(qiáng)度。MetaXpress用戶自定義模塊可進(jìn)行多參數(shù)圖像分析，量化不同的生物學(xué)結(jié)果。使用代表一批不同等 級(jí)抗癌藥物的化合物來描述細(xì)胞球測(cè)定的表現(xiàn)。 

圖 1. 代表各種表型的細(xì)胞球目前較大投影圖像。圖像分析數(shù)據(jù)為細(xì)胞核計(jì)數(shù)和細(xì)胞分類結(jié)果:柱狀圖:對(duì)照(0.1%DMSO)， 紫杉醇150nM，依托泊苷200μM，十字孢堿300nM，絲裂霉素C1μM，阿霉素1μM和氟腺嘌呤100μM。幾何學(xué)或平均強(qiáng) 度值依據(jù)DMSO對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(設(shè)為1000)。已選化合物的濃度依賴作用和4參數(shù)曲線擬合。紅色-紫杉醇，深紅-十字孢 堿，藍(lán)色-阿霉素，綠色-絲裂霉素C，青色-依托泊苷和紫色-氟腺嘌呤。 

固態(tài)培養(yǎng)基多細(xì)胞球分析：

采用相同方式進(jìn)行半固體培養(yǎng)基中細(xì)胞球成像及分析。選擇共聚焦方式采集圖像，沿Z軸間隔5-10um拍 攝各層面圖像，再做目前較大投影分析。用戶自定義模塊可進(jìn)行單細(xì)胞球計(jì)數(shù)和特征分析，同時(shí)也可計(jì)算細(xì)胞球 中活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)。化合物處理導(dǎo)致克隆的數(shù)量和大小降低，也減少了活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。 

圖 2.Matrigel中Hoechst和鬼筆環(huán)肽-AF488染色的細(xì)胞球目前較大投影圖像。由用戶自定義模塊產(chǎn)生的細(xì)胞分類結(jié)果的圖像分 析數(shù)據(jù)獲取。已選化合物的濃度依賴作用及4參數(shù)曲線擬合。紅色-依托泊苷，綠色-紫杉醇，藍(lán)色-十字孢堿，紫色-絲裂 霉素C。 

細(xì)胞球物體3D特征分析：

3D分析可應(yīng)用于不同Z平面物體的，也可應(yīng)用于細(xì)胞球或其他物體的3D特征和形態(tài)學(xué)分析。細(xì) 胞球物體分析要求計(jì)算所有物體的數(shù)量:細(xì)胞球或單個(gè)細(xì)胞，也包括細(xì)胞球中的細(xì)胞數(shù)。多參數(shù)圖 像分析用來量化不同生物學(xué)數(shù)據(jù)。 

圖 3.Hoechst和鬼筆環(huán)肽-AF488染色的Matrigel中單個(gè)細(xì)胞球Z平面。注意不同的焦面有不同的物體。 

圖 4.Matrigel基質(zhì)中細(xì)胞球計(jì)數(shù)和Hoechst染色的單個(gè)細(xì)胞核計(jì)數(shù)。帶有細(xì)胞球物體分析功能的用戶自定義模塊 所獲取的圖像分析結(jié)果。已選化合物的濃度依賴作用及4參數(shù)曲線擬合。紅色-阿糖胞苷，綠色-順鉑，藍(lán)色-氟腺 嘌呤，紫色-阿霉素。 

總結(jié)：

我們已經(jīng)開發(fā)出利用共聚焦系統(tǒng)和高內(nèi)涵成像的高通量定量檢測(cè)方法，這一方法可以評(píng)價(jià)3D癌細(xì)胞模型的活力及形態(tài)學(xué)改變。 

高分辨率和多參數(shù)分析利用單細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類對(duì)各種細(xì)胞球表型和藥物作用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)特征描述。 

2D和3D分析可對(duì)細(xì)胞球和單個(gè)細(xì)胞做特征描述并提供量化的檢測(cè)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可用于計(jì)算IC50s和各種化合物效力的比較。這一方法的有效性也已通過在384孔板格式下對(duì)一組抗癌藥物的篩選所證明。