產(chǎn)品特點：

• zui小樣品量低至0.5 μL

• 從1.0 ng/μL到2,500 ng/μL的DNA定量

• LCD觸摸屏可獨立完成實驗及數(shù)據(jù)分析

• 比色皿法可進(jìn)行動力學(xué)法和波長掃描

背景介紹：

分光光度測定法是一項定量和分析生物成分的成熟技術(shù)。其中，核酸是生物實驗室zui常檢測的生物成分之一。確定這些樣品的濃度和純度對許多下游實驗至關(guān)重要，例如PCR、qPCR測序和DNA基因芯片。

核酸主要吸收260nm下的紫外光，其濃度可以應(yīng)用比爾-朗伯特定律通過它們的相關(guān)消光系數(shù)和樣品光程計算出來。首先，260nm的紫外光直接照射樣品，并且穿過樣品，而另一邊的光電檢測器則測定有多少光被吸收。通過對照參比(一般是樣品稀釋液)，可以定量樣品中的核酸濃度。

樣品純度是核苷酸定量的一個重要指標(biāo)。盡管不是確定純度zui準(zhǔn)確的方法，A260/A280和A260/A230依然可以用來粗略估計蛋白和化學(xué)成分的污染程度。

SpectraMax® QuickDrop™分光光度計是一款多用途的紫外-可見(UV-Vis)超微量分光光度計，尤其是在分析核酸樣品方面。它包含一個0.5mm超微量上樣孔、比色皿插槽和內(nèi)置的LCD觸摸屏，使用者可以在這一個系統(tǒng)上進(jìn)行多種實驗。

在這一應(yīng)用指南中，我們展示了Quick-Drop分光光度計是如何以高準(zhǔn)確度和高一致性來定量(濃度)和定性(樣品純度)分析核酸樣品的。

材料與方法：

• QuickDrop 紫外-可見分光光度計(Molecular Devices cat. #QUICKDROP)

• UltraPure™ 小牛胸腺DNA溶液(Thermo Fisher cat. #15633019)

• RNA Control 250(Thermo Fisher cat. #AM7155)

• 10 mm 遠(yuǎn)紫外石英比色皿(Starna Cells cat. #9-Q-10)

樣品交叉污染：

樣品交叉污染通過使用超微量上樣孔交替檢測小牛胸腺DNA和超純水進(jìn)行評價。超純水作為參比。超微量孔在每次讀數(shù)完成后用不起毛的紙擦拭干凈。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性：

溶于超純水中起始濃度為2500ng/μL的雙鏈DNA(dsDNA)經(jīng)兩倍系列稀釋。超純水作為空白，每個樣品濃度都在0.5-mm超微量上樣孔中讀3次。利用預(yù)設(shè)好的DNA定量方法，從230nm到320nm波長下檢測器吸光度值。DNA定量法自動計算出ds D N A 濃度，基于計算方程及以下26 0 n m 和320nm分別檢測出的吸光度值。

濃度μg/mL =(A260 - A320) x 稀釋因子 x 50 μg/mLQuickDrop自動運行這些計算并報告濃度給使用者。之后，數(shù)據(jù)可以使用SoftMax®Pro軟件和SoftMax Pro導(dǎo)入功能繪制圖表。雙對數(shù)曲線擬合用于顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性。

樣品體積比較：

小牛胸腺DNA采用超純水稀釋，分別是0.5 μL, 1.0 μL和2.0 μL，在超微量上樣孔中檢測(n = 5)。超純水作為參比。參比體積與樣品體積相同。

RNA 驗證：

ThermoFisher的RNA質(zhì)控250用于比較QuickDrop分光光度計和NanoDrop™分光光度計的性能表現(xiàn)。試劑盒中提供的儲存液作為參比。參比樣品和RNA質(zhì)控品均于超微量上樣孔中檢測。所得結(jié)果與RNA質(zhì)控試劑盒說明書中的參數(shù)做比較。

污染物檢測：

樣品DNA被50 μM苯酚溶液污染。污染的樣品和質(zhì)控品在比色皿模塊中使用“波長掃描”功能檢測。這一功能在整個波長范圍內(nèi)遞增的檢測樣品吸光度。結(jié)果使用Microsoft® Excel繪制曲線。

結(jié)果：

樣品交叉污染：

樣品交叉污染在QuickDrop超微量上樣孔中檢測。圖1和表1中的結(jié)果顯示經(jīng)過不起毛的簡單擦拭后，后續(xù)實驗中沒有明顯的樣品交叉污染。

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性：

在圖2中，QuickDrop展示出DNA濃度和稀釋因子之間的線性關(guān)系。從這個實驗中，我們可以得出QuickDrop的zui低檢測濃度為1 ng/μL DNA。

樣品體積比較：

3個不同體積DNA樣品在QuickDrop超微量上樣孔中進(jìn)行檢測。計算出的樣品DNA濃度在不同體積下都是一致的(圖3)。為了得到的結(jié)果，我們建議使用2-μL體積，因為其更易加樣。

RNA驗證：

對RNA 250質(zhì)控品的檢測說明了Quick-Drop完夠用于檢測RNA。所測濃度在質(zhì)控品試劑盒提供的可接受范圍之內(nèi)(250 ±5 ng/μL)。

污染物檢測：

使用波長掃描功能，污染物可以從樣品中識別出來，通過在230nm處與對照比較，有上升的吸光度值(圖5)。這一功能可以應(yīng)用于DNA純化過程中其他類型污染物的發(fā)現(xiàn)，如硫氰酸胍。QuickDrop的有效波長范圍可從190nm到1100nm，對全面分析各類化學(xué)品都很有幫助。

總結(jié)：

QuickDrop內(nèi)置的比色皿模塊和超微量上樣孔都能夠進(jìn)行非常靈敏的核酸樣品定量及分析。如以上所示，低至0.5 μL的樣品也能在超微量孔中得到一致性很高的讀數(shù)。同時， 還具有非常寬的檢測范圍(1 ng/μL to 2500 ng/μL)和非常低的樣品交叉污染。

zui后，內(nèi)置的LCD觸摸屏為研究者提供了重要信息，如樣品濃度和純度(圖6)。所有這些特點， 加上它小巧靈活的體積，QuickDrop分光光度計將成為在任何實驗室環(huán)境下進(jìn)行核酸定量和分析的理想選擇。