簡介

DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）是一種熒光染料，常用于核 DNA 染色。它用于熒光顯微鏡、染色體擴散、FACS 和細胞檢測等成像實驗 【1-4】。然而，紫外光激發(fā)會導致 DAPI 的光轉換，從而在成像系統(tǒng)的 FITC/GFP 通道中檢測 DAPI 熒光，從而導致結果解釋錯誤 【5， 6】。DAPI 還需要固定細胞以實現染色。在這個亮點中，我們展示了 DAPI 染色的一些替代方法，包括 StainFree 技術，該技術不需要染色，并且可與活細胞一起使用。

Molecular Devices SpectraMax® i3 多功能微孔板酶標儀采用 SpectraMax® MiniMax 300 成像細胞計數儀，使用StainFree 細胞檢測技術來定量細胞。這種非標記方法使用透射光成像和復雜的軟件來識別單個細胞或細胞群。用戶可以“教導"軟件通過監(jiān)督機器學習算法來識別細胞。這使得科學家能夠對細胞進行計數并監(jiān)測細胞生長，而不會在昂貴的染色程序中損害細胞或損失時間和金錢。

DAPI 的另一種替代方法是 Molecular Devices EarlyTox 活細胞紅色染料。這種細胞滲透性紅色熒光染料可對培養(yǎng)物中所有細胞的核 DNA 進行染色，無論其活性如何，并可在需要核染色的成像檢測中用作 DAPI 的替代物。在 622 nm 激發(fā)和 645 nm 峰值發(fā)射的情況下，活的紅色染料在成像檢測中不會干擾 FITC 通道。

我們進行了一項細胞計數實驗，以證明 StainFree 技術和活細胞紅色染料方法與 DAPI 染色相比的性能。DAPI 的兩種替代方案均為用戶提供了對活細胞進行計數的優(yōu)勢，而無需耗時的固定步驟。StainFree 技術使用戶不受染色程序的限制，并使他們能夠使用細胞進行額外的下游分析。

優(yōu)勢

• 使用 StainFree 技術實現活細胞計數，同時無需染色前的固定步驟，避免昂貴
的染色程序
，節(jié)省時間和金錢

方法

CHO-K1 細胞以 20，000 至 300 個細胞/孔的密度接種到 96 孔板中，連續(xù)進行兩倍稀釋，并在 37°C 下附著并生長過夜。 孵育后，在 37°C 下用含 4% 多聚甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水 （PBS） 固定孔的子集 30 分鐘。 固定后，用 1X PBS 洗滌細胞兩次，然后在 0.1% Triton X-100 中孵育 5 分鐘。用 PBS 洗滌細胞兩次，并用 PBS 中的 2.9 µM DAPI 染色 30 分鐘。染色后，用 PBS 洗滌細胞三次。

剩余的活細胞，并用活紅色染料染色。將染料儲備溶液在 PBS 中以 1：2000 的比例稀釋并添加到細胞中。孵育 30 分鐘后，使用 MiniMax 細胞儀上的透射光和紅色熒光 （Cy5） 通道對活細胞進行成像。使用 SoftMax Pro 軟件進行 StainFree 分析和核計數。圖 1 顯示了使用 StainFree 或 Live Red Dye 節(jié)省的時間。

為了進行比較，在 ImageXpress® Micro XLS 寬場高內涵分析系統(tǒng)中使用 Cy5 和 DAPI 通道對活（紅色染色）和固定（DAPI 染色）細胞進行成像。按順序為比較兩個成像系統(tǒng)的細胞計數，將目標區(qū)域 （ROI） 應用于使用 
MiniMax 細胞計數器采集的圖像，以匹配 ImageXpress Micro XLS 系統(tǒng)上成像的區(qū)域。使用 SoftMax Pro 軟件創(chuàng)建圖形。

圖 1：使用 StainFree 技術與活紅色染料與DAPI。 與使用 DAPI 進行固定和染色相比，StainFree 工作流程可節(jié)省約 70 分鐘的時間。此外，使用 StainFree 技術分析的細胞仍然存活，并可用于其他檢測。

結果

用活紅色染料染色并在 MiniMax 細胞計數器的紅色熒光和透射光通道上成像的細胞如圖 2 所示。對于紅色熒光圖像，使用 SoftMax Pro 軟件中的預定義“Nuclei"設置來準確識別染色的細胞核。對于在透射光通道中成像的細胞，使用 StainFree 技術來識別細胞。軟件中的預定義設置“CellsA"為這些 CHO 細胞實現了精確的結果。StainFree 細胞計數與熒光細胞核計數非常接近（圖 2，圖），表明 MiniMax 細胞計數儀和 SoftMax Pro 軟件可準確消除對細胞核染色計數的需求。使用 ImageXpress Micro XLSsystem 和 MetaXpress® 軟件對 DAPI 染色的細胞進行成像和計數。對于比較，使用 Cy5 通道在同一系統(tǒng)上對活的紅色染料染色細胞進行
成像。染色細胞的圖像如圖 3 所示。使用兩種染料的細胞計數非常接近（圖 3，圖）。通過此比較，我們確認使用 DAPI 的細胞計數與使用 StainFree 技術的細胞計數相當。

圖 2. 使用 MiniMax 細胞計數器對細胞進行計數。 用活紅色染料染色的細胞在紅色熒光（左上）或透射光（中上）通道中成像。StainFree 細胞計數（右上角，紫色掩膜）與基于紅色細胞核染色的細胞計數密切相關，如圖所示（綠色圓圈，StainFree 計數；紅色圓圈，紅色細胞核計數）。兩條曲線的 r2 值為 0.99。

圖 3. 在 ImageXpress XLS 系統(tǒng)中計數的細胞。 對用活紅色染料（左上）或 DAPI（右上）染色的細胞進行成像，并通過在 SoftMax Pro 軟件（下圖）中繪制圖表來證明使用兩種染料獲得的計數的密切相關性。對于兩條曲線，r2 均為 0.99。

結論

Stain Free 技術 和 Live Red Dye 在細胞計數方面與 DAPI 一樣有效，DAPI 需要在染色前進行固定。StainFree 細胞計數是最大限度地提高細胞活性和減少細胞處理時間的好選擇，因為它既不需要熒光染料，也不需要固定。對于需要細胞核染料的情況，例如，為了監(jiān)測細胞核大小或染色水平，可以使用活的紅色染料代替 DAPI，但不需要固定。它也不會干擾綠色熒光成像，因為 DAPI 已被證明是如此。使用 StainFree 技術或 Live RedDye 可實現活細胞檢測的更多多功能性。