簡介

人們對使用更復(fù)雜、更具生物相關(guān)性和預(yù)測性的細(xì)胞水平平臺來開發(fā)檢測和篩選化合物的興趣日益增加。StemoniX® microBrain® 3D Assay Ready 板是一個高通量 3D 培養(yǎng)平臺，更接近于天然的人類大腦皮層組織的發(fā)育和構(gòu)成。每個細(xì)胞球均由活性皮質(zhì)谷氨酸和 GABA 能神經(jīng)元的混合物組成，這些神經(jīng)元與來自單個供體來源的星形膠質(zhì)細(xì)胞共同成熟。這種平衡的細(xì)胞混合物允許開發(fā)富含突觸的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，從而形成一個功能強大的神經(jīng)元電路。microBrain 3D 細(xì)胞球中的神經(jīng)細(xì)胞具有生理活性，自發(fā)性、同步神經(jīng)元活性可作為鈣振蕩進行檢測。

在 FLIPR® Tetra 高通量篩選系統(tǒng)上使用快速動力學(xué)熒光成像來測量神經(jīng)球的鈣振蕩模式和頻率，通過鈣敏感染料監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化。測試了一組已知的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，包括 NMDA、GABA 和 AMPA 受體的激動劑和拮抗劑，以及花生酸、鎮(zhèn)痛藥和抗癲癇藥。隨著振蕩模式的抑制或激活，觀察到變化，并與每種神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的預(yù)期效應(yīng)相關(guān)。

我們還測試了一系列神經(jīng)毒性化合物，包括選定的殺蟲劑和阻燃劑，并證明了該檢測對化合物效應(yīng)的敏感性。該檢測經(jīng)過優(yōu)化，可在 384 孔板中進行高通量篩選，并可通過使用 ScreenWorks Peak Pro軟件進行多參數(shù)分析來表征神經(jīng)細(xì)胞球中的振蕩曲線。

自動測量的讀數(shù)包括振蕩速率、峰值頻率、峰值寬度、振幅和波形不規(guī)則性。

使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)，通過高內(nèi)涵成像評估化合物處理對細(xì)胞活性和線粒體完整性的潛在影響。測定了不同化合物對 Ca2+ 振蕩速率或細(xì)胞活性的影響的 EC50 值。在此，我們證明了使用人 iPSC 源性細(xì)胞形成的 3D 神經(jīng)細(xì)胞球的功能和形態(tài)測定可用于評估候選藥物，以及使用鈣振蕩和高內(nèi)涵成像進行神經(jīng)毒性評估。

優(yōu)勢

利用更接近體內(nèi)環(huán)境的高通量 3D 培養(yǎng)平臺

表征神經(jīng)元功能和細(xì)胞毒性測定

使用功能、結(jié)構(gòu)和末端終點評估候選藥物并評估神經(jīng)毒性

材料

•       StemoniX microBrain 3D Assay Ready 384 孔板（StemoniX，cat.  #BSARX-AA-0384）

•       Sorvall 離心機

•       FLIPR 鈣 6 試劑盒（Molecular Devices，cat.  #R8190）

•       活性染料 Calcein AM（Invitrogen，cat.  #C3100MP）

•       線粒體電位染料 MitoTracker Orange（Invitrogen，cat.  #M7510）

•       Hoechst 核染料（Invitrogen，cat.  #H3570）

•       配備 ScreenWorks Peak Pro 軟件的 FLIPR Tetra 系統(tǒng)（Molecular Devices）

•       ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)與 MetaXpress 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件（Molecular Devices）

利用更復(fù)雜、更具生物相關(guān)性和預(yù)測性的細(xì)胞平臺

StemoniX microBrain 3D Assay Ready 384孔板由 StemoniX， Inc. 提供。 高通量 3D 培養(yǎng)平臺與天然人腦組織的發(fā)育和組成更相似。在該平臺中，直徑約 600 μM  的人 iPSC 源性神經(jīng)細(xì)胞球由生理學(xué)上相關(guān)的功能活性皮質(zhì)谷氨酸和 GABA 能神經(jīng)元（通過 MAP2 識別；綠色）和星形膠質(zhì)細(xì)胞（通過 GFAP 識別；紅色）共同培養(yǎng)組成，如圖 1 所示。這種平衡的細(xì)胞混合物允許開發(fā)富含突觸的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，從而形成一個功能強大的神經(jīng)元電路。microBrain 3D 細(xì)胞球中的神經(jīng)元細(xì)胞具有生理活性，具有自發(fā)的、同步的、易于檢測的鈣振蕩。該高級神經(jīng)平臺已針對 384 孔板中的高通量篩選進行了優(yōu)化，并在不同的孔和板中顯示出高度一致的功能表現(xiàn)。

圖 1：明場和免疫染色 StemoniX microBrain 3D 細(xì)胞球。A） 明場圖像。B） 免疫染色細(xì)胞球顯示活性皮質(zhì)谷氨酸和 GABA 能神經(jīng)元通過 MAP2 識別；綠色，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過 GFAP 識別；紅色，細(xì)胞核通過 DAPI 識別；藍色。使用 ImageXpress Micro Confocal共聚焦系統(tǒng)采集圖像。

方法

設(shè)置 3D 神經(jīng)培養(yǎng)物

StemoniX microBrain 板在常溫條件下預(yù)裝。每個孔包含單個大小統(tǒng)一的人 iPSC 源性皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞球，成熟 8-12 周。在到達當(dāng)天，將板以 200 x g 離心 5 分鐘，用顯微鏡檢查以確認(rèn)細(xì)胞球沉降到板孔底部，用 70% 乙醇進行除污，不要密封。之后，更換培養(yǎng)基（1/2 體積，三次），將孔板置于 37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中 5-7 天。每兩天進行一次培養(yǎng)基更換。

工作流程圖如圖 2 所示。首先使用透射光對孔進行成像，以驗證是否存在細(xì)胞球。接下來，將細(xì)胞球與 FLIPR 鈣 6 染料一起孵育，并在 FLIPR Tetra 系統(tǒng)上對鈣振蕩進行成像。然后，將細(xì)胞與化合物進一步孵育，并染色以測定活性，在 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)上進行分析。

使用鈣流測定法評估對鈣振蕩的早期影響

 如 Sirenko、Grimm 等人 在20171 年所描述的，使用FLIPR Calcium 6試劑評估神經(jīng)元胞內(nèi)Ca2+流。使用 FLIPR Tetra 系統(tǒng)，在 470-495 nm 激發(fā) 10 分鐘后，以 8 Hz 的頻率在 515-575 nm 處測定細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 流動力學(xué)。每次讀取的曝光時間為 0.05s，增益設(shè)置為 2000，激發(fā)強度設(shè)置為 30%。儀器溫度保持在 37°C 恒定。 在初次接觸化學(xué)品后 60 分鐘測量對鈣振蕩的早期影響。對于早期時間點，在添加化合物之前，用 FLIPR 鈣 6 染料預(yù)染細(xì)胞兩小時。通常在添加化合物之前測量不含化合物的鈣振蕩的基線。對于 24 小時實驗，在添加 FLIPR 鈣 6 染料之前，將細(xì)胞暴露于適當(dāng)濃度的化學(xué)品中 22 小時。再添加 FLIPR 鈣 6 染料（4 倍濃度）兩小時，添加額外體積的化合物以保持化合物濃度相同。定量數(shù)據(jù)評估，代表性的數(shù)據(jù)使用 ScreenWorks 軟件可得出峰值計數(shù)（每 10 分鐘）、平均峰值振幅、平均峰值寬度（振幅為 10%）、平均峰值間距（峰值之間的時間）、平均峰值上升時間（振幅為 10% 至 90%）和平均峰值衰減時間（振幅為 90% 至 10%）等描述。

對活細(xì)胞進行染色以評估表型變化

使用三種染料對活細(xì)胞進行染色：活性染料 Calcein AM （1 pM）、線粒體電位染料 MitoTracker Orange （0.2 pM） 和 Hoechst 核染料 （2 pM）。為了評估神經(jīng)特異性標(biāo)記物，用 4% 甲醛 （Sigma） 固定細(xì)胞，并用抗MAP2 和抗 GFAP 抗體 （BD Biosciences） 染色。

使用高通量 3D 成像和分析評估神經(jīng)毒性

使用帶有 10X Plan Fluor 物鏡的 ImageXpress Micro Confocal 系統(tǒng)對細(xì)胞球進行成像。細(xì)胞球檢測的方法和采集設(shè)置如前所述2。從孔底開始采集由 10-15 μm 分隔的 19 張圖像的 z 堆棧，并向上移動以覆蓋每個細(xì)胞球的光穿透部分（深度約 100-150 μm）。所有單個圖像均被保存并用于 3D 分析和 2D 投影（最大投影）分析。使用 MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中的自定義模塊編輯器分析圖像。分析方法之前已在 Sirenko， Mitlo 等人于20152 年進行過描述。使用在 MetaXpress 自定義模塊編輯器中創(chuàng)建的程序生成針對其他多參數(shù)輸出的自定義分析。首先，自定義模塊分析識別出細(xì)胞球。其次，活細(xì)胞數(shù)量通過 Calcein AM 信號的存在來識別。第三，通過 MitoTracker Orange 染色檢測具有完整線粒體的細(xì)胞數(shù)量。死細(xì)胞通過 Calcein AM 信號的缺失或降低來識別。類似方法可用于 3D 圖像分析，以評估 3D 中的神經(jīng)毒性和測量值推導(dǎo)，如 Sirenko、Hancock 等人 20163 年所描述的。

圖 2. 利用 3D 培養(yǎng)平臺進行動力學(xué)和細(xì)胞成像分析的多參數(shù)工作流程。1） StemoniX microBrain® 3D Assay Ready 384孔板經(jīng)過培養(yǎng)，然后在 ImageXpress Micro 共聚焦系統(tǒng)上使用透射光觀察。2） 將細(xì)胞球與鈣敏感染料和神經(jīng)毒性化合物一起孵育。藥物處理時，在 FLIPR Tetra 系統(tǒng)上分析振蕩速率的變化。3） 使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)對染色的細(xì)胞進行功能和活性篩選。

結(jié)果

神經(jīng)調(diào)節(jié)劑對鈣振蕩的影響

microBrain 3D 細(xì)胞球中的神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生自發(fā)的、同步的鈣振蕩。我們在 FLIPR Tetra 系統(tǒng)上使用動態(tài)熒光成像來測量神經(jīng)細(xì)胞球 Ca2+ 振蕩的模式和頻率，通過孵育兩小時后 FLIPR 鈣 6 染料的細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 水平變化進行監(jiān)測。測試了一組已知的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，包括激動劑和拮抗劑NMDA、GABA 和kainate 受體。用化合物孵育一小時后，在 10 分鐘內(nèi)測定細(xì)胞球的鈣振蕩頻率。來自其中六種化合物的振蕩模式如圖3A所示。注意與對照相比，振蕩模式的差異。IC50 值和每種化合物的作用機制如圖 3B 所示。

圖 3. 神經(jīng)活性化合物的評估。A） 在 FLIPR Tetra 系統(tǒng)上評估 10 分鐘內(nèi)鈣振蕩的樣本軌跡。用 FLIPR 鈣 6 染料處理細(xì)胞球兩小時，并用化合物處理一小時。B） 作用機制和 IC5o 值根據(jù) 10 分鐘內(nèi)峰值速率的濃度反應(yīng)曲線確定，采用 4 參數(shù)曲線擬合。

神經(jīng)毒性效應(yīng)評估

許多工業(yè)和環(huán)境化學(xué)品都報告了對人體的神經(jīng)毒性作用。此處描述的方法可用于通過評估鈣振蕩模式和細(xì)胞活性的變化來篩選化合物的潛在神經(jīng)毒性。為了評估神經(jīng)毒性作用，將神經(jīng)細(xì)胞球與幾種已知的神經(jīng)毒性化合物一起孵育 24 小時，然后加入 FLIPR 鈣 6 染料兩小時。

在 FLIPR Tetra 系統(tǒng)上測量鈣振蕩。數(shù)據(jù)子集如圖 4 所示。與對照相比，神經(jīng)毒性化合物引起鈣振蕩模式擾動。具體而言，對于用指定化合物處理的樣品，觀察到峰值頻率降低或信號振幅明顯更小。

圖 4. 評估殺蟲劑、工業(yè)化合物和阻燃化合物的神經(jīng)毒性作用。A） 由 FLIPR Tetra 系統(tǒng)評估的 10 分鐘內(nèi)的樣品軌跡。將一組選定的神經(jīng)毒性化合物與 iPSC 源性 microBrain 神經(jīng)細(xì)胞球一起孵育 22 小時。FLIPR 鈣 6 染料與細(xì)胞和化合物一起再孵育兩小時。在 10 分鐘內(nèi)記錄鈣振蕩。B） 該表列出了化學(xué)類別和 IC50 值，這些值根據(jù) 10 分鐘內(nèi)使用 4 參數(shù)曲線擬合的峰值速率的濃度反應(yīng)曲線確定。

使用高內(nèi)涵成像評估細(xì)胞活性和線粒體完整性

共聚焦成像和 3D 圖像分析方法用于表征化合物對 3D 神經(jīng)細(xì)胞球形態(tài)和活性的影響。為了評估細(xì)胞毒性作用，用多種化合物處理細(xì)胞 24 小時，然后用 Hoechst 核染料、Calcein AM 和 MitoTracker Orange 染料對活細(xì)胞進行染色。然后使用 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦系統(tǒng)，通過 DAPI、FITC 和 TRITC 通道以及 10X 物鏡對細(xì)胞球進行成像。對照細(xì)胞球和

用環(huán)境毒素甲基汞處理的細(xì)胞球如圖 5 所示。使用 MetaXpress 軟件中的自定義模塊編輯器生成成像讀數(shù)分析。首先，分析識別出細(xì)胞球。其次，活細(xì)胞數(shù)量通過 Calcein AM 信號的存在來識別。第三，通過 MitoTracker Orange 染色檢測具有完整線粒體的細(xì)胞數(shù)量。通過Calcein AM 信號的缺失或減少來識別死細(xì)胞。

圖 5. 對照細(xì)胞球和經(jīng) 1 mM 甲基汞處理的細(xì)胞球的最大投影圖像。 以藍色顯示的細(xì)胞核，以綠色顯示的Calcein AM染色，以橙色顯示的線粒體染色。下圖所示的圖像分析掩膜包括細(xì)胞球掩膜（白色）、完整線粒體染色陽性的細(xì)胞核（深藍色）、線粒體染色陰性的細(xì)胞核（紅色）和陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（淺藍色）。在上述示例中，未經(jīng)處理的細(xì)胞球中有 608 個陽性細(xì)胞（具有完整的線粒體）。在用甲基汞處理的細(xì)胞球中，陽性細(xì)胞的數(shù)量降至 228個。 

結(jié)論

總之，我們證明了神經(jīng)細(xì)胞球?qū)υu估神經(jīng)毒性作用有反應(yīng)，并可用于評估各種化合物的神經(jīng)毒性作用。我們還證明，該檢測可作為高通量檢測形式進行修改，并可用于化合物篩選。

多參數(shù)分析可提供信息豐富的讀數(shù)，從而能夠篩選測試化合物對神經(jīng)元活性以及細(xì)胞形態(tài)和活力的影響。用于神經(jīng)毒性評估的表型描述包括鈣振蕩峰計數(shù)、振幅、間距和峰寬，以及 Calcein AM 或 MitoTracker Orange 陽性的細(xì)胞數(shù)量?？舍槍Σ煌淖x數(shù)計算化合物的有效濃度，然后根據(jù)化合物的潛在神經(jīng)毒性危險對其進行排序。該方法用于評估化合物庫中的化合物的毒性作用，該庫包含不同類別化學(xué)品的代表性實例，包括藥物、殺蟲劑、阻燃劑和多芳香烴。

參考文獻：

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3.       Sirenko, O., Hancock, M. K., Hesley, J., Dihui, H., Avrum, C., Jason, G., Carlson, C. B., and Mann, D. (2016). Phenotypic characterization of toxic compound effects on liver spheroids derived from iPSC using confocal imaging and three-dimensional image analysis. Assay Drug Dev. Technol. 14, 381–394.

For additional information, please refer to the following papers

·       Sirenko, O., Parham, F., Dea, S., Carromeu, C., et.al (2018). Functional and Mechanistic Neurotoxicity Profiling Using Human iPSC-Derived Neural 3D Cultures. Toxicological Sciences 167(1).

·       Anson, B. D., Kolaja, K. L., and Kamp, T. J. (2011). Opportunities for use of human iPS cells in predictive toxicology. Clin. Pharmacol. Ther. 89, 754–758.

·       Camp, J. G., Badsha, F., Florio, M., Kanton, S., Gerber, T., WilschBräuninger, L. E., Sykes, A., Hevers, W., and Lancaster, M. (2015). Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 15672–15677.